[发明专利]副溶血性弧菌的快速检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种副溶血性弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于：

(1) 环介导等温核酸扩增体系组分：

反应缓冲液组成：40mM的Tris-HCl(pH8.8)、20mM的KCl、16mM的MgSO₄、20mM 的(NH₄)₂ SO4：0.2%的Tween20、1.8M 的Betaine、2.6 mM的dNTPs；

(2) 一套基于副溶血性弧菌tlh 基因的环介导等温扩增技术的特异性引物：两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP。

2.如权利要求1所述的副溶血性弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于：所述的两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，其序列分别如下：

F3：   5’-CGCTGACAATCGCTTCTCAT -3’

B3：   5’-GTTCTTCGCTTTGGCAATGT -3’

FIP：  5’-CTGTCACCGAGTGCAACCACTTAACCACACGATCTGGAGCA -3’

BIP：  5’-CGCATCACAATGGCGCTTCCACCGTTGGAGAAGTGACCTA -3’。

3.如权利要求1或2所述的副溶血性弧菌的快速检测试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液经0.22u滤膜过滤，4℃保存；所述反应缓冲液中除dNTPs，其他溶液均经121℃ 15分钟高压，终溶液用无菌水定容。

4.如权利要求1所述的副溶血性弧菌的快速检测试剂盒其检测方法为：

（1）挑取可疑菌落溶于蒸馏水中，沸水浴10分钟，离心，取上清液作为检测样本核酸，取50μl增菌液或菌苔溶于50μl 去离子水，95℃，煮沸5min，热裂解法提取DNA，5000rpm/min，离心1min，取上清液，置于4℃冰箱备用；

（2）按12.5μl反应缓冲液，1μl的5μM F3/B3，1μl的 40μM FIP/BIP， 3μl的8000U/ml Bst DNA 聚合酶，2μl 的DNA模板，3.5μl的去离子水配置反应体系实现环介导等温核酸扩增；反应体系反应温度为64.5℃，时间为25min，85℃灭活5min ；最后用肉眼观察反应后颜色变化或用实时浊度仪监测结果。