[发明专利]一种优秀冰雪运动员线粒体DNA分离与纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种线粒体DNA(mtDNA)提取与纯化的方法，本发明特别适用于优秀冰雪运动员血液来源的mtDNA的提取与纯化，属于体育科学和生物科学的交叉学科。

背景技术

线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器，它含有自己的DNA，具有相对独立的遗传系统它是细胞进行氧化磷酸化的场所。线粒体基因组不仅是研究DNA结构与复制转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。

mtDNA是共价闭合的环状双链分子，对于不同的生物其分子量大小不一样。研究证实人类mtDNA的全部核苷酸序列为16569bp。mtDNA不同于核DNA的一个突出特点就是以母性遗传方式遗传，在遗传过程中mtDNA通过卵细胞质传递给后代。这种遗传方式便于进行群体分析，一个个体就能代表一个母性集团，因此只需少量个体样本便能反映一个群体的遗传结构。

优秀的冰雪运动员要具有良好的心肺功能、有氧代谢能力，其线粒体中酶活性及个数较正常人偏高。人血液中的血细胞有红细胞、白细胞和血小板。红细胞无细胞核和细胞器，血液中的mtDNA主要来源于白细胞和血小板。正常人安静时血液中的白细胞总数在4000～10000个/mm³或4～11.0×10⁹/L之间变动。白细胞生理性增高往往有以下情况，如剧烈运动、体力劳动、冷热水浴后、酷热和严寒、紫外线照射、情绪激动、刺激等因素都可导致白细胞数量增高。故总体上讲优秀冰雪运动员血液中白细胞的数量应较正常人偏多。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取mtDNA的方法。

本发明的目的是提供一种纯化mtDNA的方法

本发明所提供的提取mtDNA的方法特别适用于优秀冰雪运动员。

本发明聚焦于优秀冰雪运动员血液来源的mtDNA的提取与纯化。

本发明对传统的mtDNA提取与纯化的方法进行了筛选、改进及优化，提取高获得率和高纯度的测序级mtDNA。

具体实施方式

主要器械：

低温冷冻离心机、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液器、恒温浴槽。

药品与试剂：

溶液I：139.6mmol/L NH₄Cl，16.96mmol/L三羟甲基胺基甲烷Tris-HCl，pH7.2；

溶液II：25mmol/L Tris-HCl pH7.4，0.136mol/L NaCl，2.7mmol/L KCl；

溶液III：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH7.6，1mmol/L EDTA；

溶液A：10mmol/L Tris-HCl pH7.5，NaCl10mmol/L，MgCl₂5mmol/L；

溶液B：10mmol/L Tris-HCl pH8.0，NaCl400mmol/L，EDTA2mmol/L。

实验步骤

1、抽取优秀冰雪运动员静脉全血5mL，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。

2、破碎红细胞

(1)取EDTA抗凝血2mL，加入10mL的溶液I，混匀，静置30min，500r/min，离心8min。

(2)用溶液II适量悬浮沉淀，分盛2个Eppendorf管中，以1500r/min速度离心4min。

(3)用溶液II再悬浮沉淀，以1500r/min速度离心4min。

(4)用适量溶液III洗1次，沉淀白细胞。

3、高盐法提取mtDNA

(1)取10⁷细胞沉淀，加入溶液A5500μL，混匀，以3000r/min速度离心8min，弃上清。

(2)取沉淀加溶液B5500μL，颠倒混匀，以3500r/min速度离心10min，弃上清。

(3)弃上清，沉淀加溶液B950μL，混匀后加入20mg/mL蛋白酶K50μL和10％SDS120μL，快速混匀。40℃过夜或50℃4小时。

(4)加入300μL饱和醋酸钠，颠倒混匀，轻摇15S。4℃以13000r/min速度离心20min，取上清于Eppendrof管中。

(5)取上清后再加入300μL饱和醋酸钠，颠倒混匀，轻摇15S。4℃以13000r/min速度离心20min。

4、mtDNA的纯化