[发明专利]一种优秀冰雪运动员EB病毒转化B淋巴细胞的方法

权利要求书

1.一种高细胞转化率、高细胞无限增殖的优秀运动员永生化细胞株。

2.如权利要求1所述方法是，一种高细胞转化率、高细胞无限增殖的优秀运动员永生化细胞株的培养方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：

2.1血样采集

(1)记录采血运动员个人资料，与抽血管上的编号相对应；

(2)使用带有肝素钠的一次性抽血管，抽取运动员静脉血4ml/人；

(3)血样常温静止放置1～2d；

注：如果全血当时不能马上转化，必须做如下处理：将血样在常温下2500rpm，离心15min，离心后用巴氏管将白膜层转入含有3ml 1640全培养基的离心管内，然后将离心管放入37.5℃培养箱，置于方盘上。

2.2细胞永生化

(1)用加1％的双抗的RPMI1640基础培养基，将采集的运动员血液稀释，轻轻吹匀。

(2)淋巴细胞分离液置于37.5℃水浴锅中预热，使用时将其溶液摇匀。

(3)往装有运动员血样的15ml离心管中慢慢倒入4ml淋巴细胞分离液，使二者界面清晰，3000rpm离心10min，使血液分层；

(4)离心后离心管中分为四层，将血清下层、红细胞上层的成杨絮状的白膜层，用巴氏管移入装有6ml RPMI1640培养基的离心管中，1000rpm离心10min；

(5)离心后将上清液弃掉，再加入10ml RPMI1640培养基，1000rpm离心10min，弃上清液。重复一次后，弃去上清液，将细胞敲匀待用；

(6)将2ml含PHA的全培养基、1.4ml EB病毒、0.4ml CyA以及收集到的白细胞做成混合液，共约4ml；

(7)将混合液加入到24孔培养板中，每孔1ml；

(8)将24孔培养板置于37.5℃，5％CO₂培养箱中培养。

3.运动员永生化细胞系的培养及冻存

3.1细胞的传代

(1)永生化细胞从24孔板转移到25m²的培养瓶中继续培养；

(2)3～4d进行一次半量换液，每次半量换液即为一次细胞传代。

3.2细胞的冻存

(1)收集细胞悬液，1000rpm离心10min，弃上清；

(2)向离心管中加入预定量的冻存液，将细胞轻轻打匀，调整细胞密度为1×10⁶/ml～3×10⁶/ml，将冻存液分装到冻存管中，每管1ml；

(3)预冻：将冻存管装入降温盒中，放于4℃20～30min，然后置于一70℃预冻4h以上，提出冻存管放入

(4)冻存：提出冻存管放入液氮柜中，即完成细胞冻存。