[发明专利]一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂及其应用。

背景技术

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)，1927年首次在美国弗吉尼亚烟草上发现并报道,现已分布于世界50多个国家。中国现在局部分布，官方控制，是我国进境重要的检疫对象。我国已从荷兰进口的萝卜种子、美国进口的大豆和塞尔维亚进口的葵花种子等进口货物中截获过该病毒。

烟草环斑病毒隶属豇豆花叶病毒科（Comoviridae），是线虫传多面体病毒属（Nepovirus）的代表种。该病毒粒子是球状、等轴、直径约28ｎｍ的二十面体，壳粒由60个外壳蛋白亚基组成。TRSV寄主范围很广，可侵染54科246种植物。自然寄主有豆类、瓜类、薯类、花卉和果树等，发病后导致多种作物的产量下降50%以上。TRSV传播途径多样，可通过种子传播、嫁接、机械接种、媒介传播。汁液接种易传毒。种子传毒，种传寄主多且种传率高，如大豆种传率为40%-100%。苗木是远距离传播的主要途径。自然传播介体为线虫Xiphinema americanum和X.rivesi。土壤中的美洲剑线虫（Xiphinema americanum）的成虫和3龄幼虫单头线虫也能传毒，线虫在24小时内获毒，感染的线虫贮藏在10℃下49周后仍可传毒。烟蓟马（Thrips tabaci）的若虫、螨（Teranychus spp.）、叶蝉（Melanoplus diffentials,M.mexicanus,M.femurrubrum）、烟草叶甲（Epitrix hirtipennis）和桃蚜（Myzus persicae）也可传毒。

进境粮谷、种子、苗木中植物病毒的检测是我国检验检疫系统的重点，也是难点，尤其是木本植物中病毒的检测，由于它们在植株体内含量低、分布不均，且时有复合侵染等特殊性，传统的方法，极易出现漏检和误检。为了维护我国农业的健康发展、防止烟草环斑病毒随粮谷、种子、苗木等传入中国，开发出快速、灵敏检测该病毒的先进的技术，意义重大。

近年来，国内关于烟草环斑病毒检测技术的研究报道较多，主要采用血清学方法、胶体金免疫层析法或分子生物学方法。如曹成等建立了双重胶体金层析法快速检测烟草环斑病毒的方法（曹成,魏梅生，张永江等，双重胶体金层析法快速检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒RT-PCR扩增子[J]．中国农学通报，2011,27(22):197-201．）；杨翠云等建立了RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法(杨翠云，曹洁，于翠，等．烟草环斑病毒RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法的研究[J]．上海农业学报，2007，23(1)：83-87．)；易汪雪等建立了单管实时荧光RT-PCR方法。常规的RT-PCR方法检测也有相关的报道(易汪雪，陈舜胜，杨翠云，等．单管实时荧光RT-PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒[J]．植物病理学报，2011，41(1)：85-92．)。

ELISA技术操作步骤繁琐、检测周期长、灵敏度低、易出现假阳性。PCR凝胶电泳技术较ELISA在多个方面有所提高，但易于造成污染。未见采用半巢式-实时荧光PCR检测TRSV的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂及其应用。

本发明提供的辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂，包括特异引物；所述特异引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成。

所述试剂可由所述特异引物和特异探针组成；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述特异探针可为TaqMan探针。

所述试剂可用于制备辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂盒。

本发明还保护一种辅助鉴定烟草环斑病毒的试剂盒，包括所述试剂。

所述试剂可用于辅助鉴定烟草环斑病毒。

本发明还保护一种辅助鉴定烟草环斑病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对甲进行PCR，得到PCR产物甲；以待测病毒的cDNA为模板，用特异引物对乙进行PCR，得到PCR产物乙；如果PCR产物甲为309bp且PCR产物乙为245bp，待测病毒为候选的烟草环斑病毒；所述特异引物对甲为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对；所述特异引物对乙为序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA组成的引物对。