[发明专利]用于鉴别猪链球菌33种血清型的引物组合及检测试剂盒

说明书

本发明提供了用于鉴别猪链球菌33种血清型的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～62所示，利用多重PCR（mPCR）方法，采用本发明提供的引物组合，能够快速准确地检测待测菌是否属于猪链球菌，属于猪链球菌的哪个血清型。本发明还提供了鉴别猪链球菌33种血清型的试剂盒。本发明的检测方法及其试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测猪链球菌33种血清型的引物组合和多重PCR（mPCR）检测方法，本发明还涉及利用该引物进行猪链球菌33种血清型检测的试剂盒。

背景技术

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种世界性的可致猪疾病的最重要病原菌之一，同时它也是一种人兽共患病病原体。人感染猪链球菌的途径主要是接触病死猪,致病菌经破损皮肤和黏膜侵入，或食入未煮熟的病死猪肉而感染。临床上主要分为2个类型,即败血症型和脑膜炎型。另外，猪链球菌还可侵入人体的关节、眼睛和心脏等，引起化脓性关节炎,眼内炎,心内膜炎和休克等。在近些年，人感染猪链球菌的报道大量增加，而这些病例主要来自亚洲国家。在越南，猪链球菌成为最常见的成人细菌性脑膜炎的病原菌；在香港，猪链球菌认为是第三位最常见的经培养确认的导致社区获得性脑膜炎的病原体；在我国大陆，尤以1998年和2005年爆发的猪链球菌疫情最为严重。其中，2005年6月份我国四川省爆发的猪链球菌疫情中有215例病人，病死率将近20%。

目前，公认的猪链球菌的血清型有33种（1-31,33,1/2），在病猪中，血清2型为最常见的临床分离型，在亚洲国家，其次为3,4,5,7,8,和1/2型；在欧洲其次为9,1和14；而加拿大最常见的血清型为2,3和1/2型，其次为4,7和8。血清2型也是猪链球菌感染人的最常见型别，此外血清1,4,5,14,16,和24在人病例中也有报道。

血清分型不仅是用来了解猪链球菌某一次特定爆发的流行情况或者监测血清型流行情况的一种很重要并且很有价值的诊断方法，而且还对疫苗的研制有重要指导意义。目前，猪链球菌的血清型主要通过凝集实验和协同凝集实验来检测，但是这种方法是既耗时，又费力，且较为昂贵，结果判读主观差异较大。此外，有相当一部分自凝菌株的血清型是无法鉴定的。

猪链球菌的血清型主要取决于其荚膜（CPS）的抗原性，而荚膜的产生又受控于基因组中的荚膜合成基因簇（cps）。与传统的用抗血清检测血清型比较，基于血清型特异cps基因的PCR方法是一种简单，可靠，且经济的方法。有15种血清型1,14,2,1/2,3,4,5,7,8,9,10,16,19,23,和25型的cps基因簇已经公布，同时也针对cps基因发展了一些单重PCR和多重PCR方法来检测这些型别。但是由于缺乏对其他18种型别的序列信息的了解，导致这一分子分型方法还未行成一种完善的检测体系。之前的研究由于对各血清型的基因组信息了解不全，故血清型特异基因的认定只能通过southern杂交的方法来确定，此法也会受一些实验因素的影响，且也较为费时费力。临床实践中，迫切需要建立一套完善的检测体系能够方便、准确、快捷地检测猪链球菌33种血清型。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供用于鉴别猪链球菌33种血清型的靶基因。

本发明的第二个目的在于提供针对上述靶基因的特异性引物；

本发明的第三个目的在于提供鉴别猪链球菌33种血清型的试剂盒。

本发明对猪链球菌（Streptococcus suis）全部33种血清型的参考菌株进行了Illumina Solexa高通量全基因组测序。并且建立了基于cps型特异基因多糖聚合酶（wzy）的多重PCR（mPCR）检测猪链球菌血清型的方法。