[发明专利]固定化乙醛脱氢酶及其制备方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及固定化乙醛脱氢酶及其制备方法。

【背景技术】

壳聚糖(chitosan)是从虾、蟹等甲壳类动物的外壳中提取的一种氨基多糖，其来源丰富，应用十分广泛。壳聚糖分子中游离氨基较多且无毒、生物相容性好。壳聚糖作为固定化酶载体还具有机械性能好，化学性质稳定，耐热性好以及使酶免受金属离子抑制等优点。双功能试剂如戊二醛等与壳聚糖及酶蛋白上的氨基均能发生Schiff反应，因此可用来作为固定化酶的交联剂。目前国内外已有不少研究者将壳聚糖作为酶固定化的载体，其开发应用前景十分广泛。乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10，Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)属于氧化还原酶类，广泛存在于真核生物和原核生物中，在辅酶Ⅰ存在的条件下，它催化包括乙醇在内的某些一级或二级醇、醛、酮的脱氢反应。在人类和其他许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时乙醛脱氢酶在分子生物学及相关疾病的检测方面也有很多应用。因此，乙醛脱氢酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。目前，有关乙醛脱氢酶固定化的报道相对较少，本文以壳聚糖作为载体，采用吸附交联法固定乙醛脱氢酶，确定了酶固定化的最佳条件，并对固定化乙醛脱氢酶的部分性质进行了探讨。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是提供一种固定化乙醛脱氢酶的制备方法，其简便易行、成本较低。

上述技术问题通过以下技术方案实现：

一种固定化乙醛脱氢酶的制备方法，其特征在于包括：

1)：乙醛脱氢酶溶液的制备：称取2g的粗酶粉，先加入20ml-40ml的浓度为5mmol/L的NaHCO₃溶液进行研磨，然后用浓度为5mmol/L NaHCO₃溶液定容至100mL，4000r/min离心5min-10min，取上清液于4℃下保存备用；

2)：将壳聚糖载体用浓度为5mmol/L的NaHCO₃溶液浸洗平衡，抽干，得预处理的壳聚糖载体；

3)：在所述预处理的壳聚糖载体中加入所述乙醛脱氢酶溶液，在4℃下吸附固定6h，得初步吸附的壳聚糖载体，其中，所述预处理的壳聚糖载体的质量g与所述乙醛脱氢酶溶液的体积mL之比为1∶2；

4)：用浓度为的5mmol/L的NaHCO₃溶液反复冲洗所述初步吸附的壳聚糖载体至洗脱液在A₂₈₀处无光吸收后，抽干，得吸附处理的壳聚糖载体；

5)：在所述吸附处理的壳聚糖载体中加入体积浓度为2％的戊二醛在4℃下交联2h，得吸附交联的壳聚糖载体，其中，所述吸附处理的壳聚糖载体的质量g与所述戊二醛的体积mL之比为＝1∶4；

6)：用浓度为的5mmol/L的NaHCO₃溶液冲洗所述吸附交联的壳聚糖载体以洗去多余的戊二醛，抽干，得到即为固定化乙醛脱氢酶。

由上述方案可知，本发明以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，用吸附交联法固定乙醛脱氢酶，本发明提供的制备方法简便易行，成本较低，为乙醛脱氢酶的应用提供了良好前景。

本发明同时还提供由上述方法制备得到的固定化乙醛脱氢酶。

【附图说明】

图1为加酶量对固定化酶活力的影响的测试结果图；

图2为吸附时间对固定化酶活力的影响的测试结果图；

图3为戊二醛浓度对固定化酶活力的影响的测试结果图；

图4为交联时间对固定化酶活力的影响的测试结果图；

图5为溶液酶和固定化酶的最适pH的测试结果图；

图6为溶液酶和固定化酶的最适反应温度的测试结果图；

图7为溶液酶和固定化酶的pH稳定性的测试结果图；

图8为溶液酶和固定化酶的热稳定性的测试结果图。

【具体实施方式】

实施例一

本实施例提供的固定化乙醛脱氢酶的制备方法，具体包括：

1)：乙醛脱氢酶溶液的制备：称取2g的粗酶粉，先加入20ml-40ml的浓度为5mmol/L NaHCO₃溶液进行研磨，然后用浓度为5mmol/L的NaHCO₃溶液定容至100mL，4000r/min离心5min-10min，取上清液于4℃下保存备用；

经检测，此乙醛脱氢酶溶液的酶活力为4.64u/g粗酶，比活力为0.21u/mg蛋白质；