[发明专利]基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法

权利要求书

1.一种重组融合抗原蛋白，其特征在于，该重组融合抗原蛋白由分泌性抗原蛋白MPB70、抗原蛋白CFP10、抗原蛋白ESAT6通过肽键依次连接组成；所述重组融合抗原蛋白具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组融合抗原蛋白，其特征在于，所述抗原蛋白MPB70位于该重组融合抗原蛋白的氨基端，抗原蛋白ESAT6位于该重组融合抗原蛋白的羧基端。

3.一种制备权利要求1~2任一所述的重组融合抗原蛋白的方法，该制备方法包括PCR扩增重组基因、构建重组基因表达载体、诱导表达重组基因、色谱纯化获得重组融合抗原蛋白，其特征在于，所述PCR扩增重组基因为利用5对引物对抗原蛋白MPB70基因、抗原蛋白CFP10基因、抗原蛋白ESAT6基因进行扩增得到重组融合抗原蛋白MPB70-CFP10-ESAT6基因；所述的引物包括：第一对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，第二对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，第三对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，第四对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，第五对引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7。

4.根据权利要求3所述的制备重组融合抗原蛋白的方法，其特征在于，所述PCR扩增重组基因的步骤如下：

步骤A：以牛结核分支杆菌基因组DNA为模板，利用序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的第一对引物扩增得到MPB70基因，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的第二对引物扩增得到CFP10基因，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的第三对引物扩增得到ESAT6基因；

步骤B：以步骤A扩增得到的CFP10基因和ESAT6基因为模板，利用序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7 所示的第五对引物扩增得到CFP10-ESAT6基因；

步骤C：以步骤A扩增得到的MPB70基因和步骤B扩增得到的CFP10-ESAT6基因为模板，利用序列表SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的第四对引物扩增得到MPB70-CFP10-ESAT6基因。