[发明专利]一种用于一氧化氮检测的荧光探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于一氧化氮检测的荧光探针及其制备方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

一氧化氮(NO)是动植物体内一种作用广泛而性质独特的信息分子，其作用贯穿整个生命过程，且作用的大小、好坏与其浓度密切相关。它参与血管调节、神经传递、炎症发生和免疫反应等；调控种子萌发、根和叶的生长发育、呼吸作用、光形态发生等，并抵抗生物及非生物胁迫。因此建立快速、灵敏、准确、适用于复杂生物体系的NO分析方法，在科学研究、疾病诊断、植物生长调控等众多领域具有重要的理论意义和广阔的应用前景。

在已有的NO分析方法中，荧光法因灵敏度高、选择性好而应用较多，但在很大程度上依赖于性能优异的NO荧光衍生试剂的开发和应用。目前可用于一氧化氮检测的荧光探针主要是荧光素邻苯二胺类（DAFs）。DAFs本身有弱荧光，能与一氧化氮在近中性条件下反应生成强荧光的产物，通过荧光强度的变化实现一氧化氮的检测。该探针的缺陷是光稳定性差，且反应产物的荧光强度易受金属离子等检测环境的影响，给检测带来较大误差。氟硼吡咯烷（BODIPY）类荧光探针以其光稳定性好、荧光量子产率高、荧光强度不受pH、溶剂等环境影响等优势，在近年来获得巨大发展，出现了一些可用于一氧化氮检测的荧光探针，但此类荧光探针共同的特点是水溶性差，用于一氧化氮检测需要使用有机溶剂，因此毒性较大，环境不友好。因此，设计合成水溶性的氟硼吡咯烷类一氧化氮荧光探针，对于一氧化氮高灵敏检测的推广应用具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种水溶性好且受环境影响小的一氧化氮荧光探针。

以解决现有一氧化氮检测中的准确性和实用性问题，及有机溶剂的使用造成的生物毒性和环境污染问题，便于一氧化氮高灵敏检测手段的推广应用。

本发明的技术方案是：一种新型水溶性氟硼吡咯烷类荧光探针，其结构如下所示：

其中，R为磺酸基（-SO₃H）或磺酸钠（-SO₃Na）。经理论计算与实验，结果表明在此两位上引入磺酸或磺酸钠，可极大增强氟硼吡咯烷水溶性，同时对探针及其一氧化氮衍生产物的荧光性质几乎无影响，是最为理想的改善探针水溶性的方式。

本发明还提供上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）将3,4-二硝基苯甲酰氯溶于二氯甲烷中，氮气保护下滴入2,4-二甲基吡咯，搅拌反应1～4天。反应后加入三乙胺，10min后再加入三氟化硼乙醚，搅拌反应1天，旋转蒸发除去溶剂。所得混合物用硅胶柱层析纯化，得到紫色粉末状中间体1,3,5,7-四甲基-8-(3’,4’-二硝基苯)-二氟化硼-二吡咯甲烷，其结构式为：

其中，3,4-二硝基苯甲酰氯、2,4-二甲基基吡咯、三乙胺、三氟化硼乙醚的摩尔比为1:2～2.5:3～5:8。

（2）将所得1,3,5,7-四甲基-8-(3’,4’-二硝基苯)-二氟化硼-二吡咯甲烷溶于无水二氯甲烷，滴加氯磺酸，氮气保护下-78°C～-40°C反应10min，待反应液恢复至室温后旋转蒸发浓缩。浓缩后向混合物中加入甲醇稀释，再加入固体碳酸氢钠使溶液至中性。过滤除去多余碳酸氢钠并旋转蒸发除去溶剂，剩余物用硅胶柱层析纯化，得到红色粉末状中间体1,3,5,7-四甲基-2,6-二磺酸钠-8-(3’,4’-二硝基苯)-二氟化硼-二吡咯甲烷，其结构式为：

其中，1,3,5,7-四甲基-2,6-二磺酸钠-8-(3’,4’-二硝基苯)-二氟化硼-二吡咯甲烷、氯磺酸摩尔比为1:2.2～10。

（3）将得到的1,3,5,7-四甲基-2,6-二磺酸钠-8-(3’,4’-二硝基苯)-二氟化硼-二吡咯甲烷溶于乙醇，在氮气保护下加入水合肼和10%的Pd/C，加热回流1～3h，点板监测反应完全后滤去Pd/C并旋干。剩余物用硅胶柱层析纯化，得到桔黄色最终产品1,3,5,7-四甲基-2,6-二磺酸钠-8-(3’,4’-二氨基苯)-二氟化硼-二吡咯甲烷固体。

其中，1,3,5,7-四甲基-2,6-二磺酸钠-8-(3’,4’-二硝基苯)-二氟化硼-二吡咯甲烷、水合肼的摩尔比为1:5～10。