[发明专利]利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽LF-6的方法

权利要求书

1.一种利用内含肽系统大肠杆菌表达乳铁蛋白改良肽LF-6的方法，其特征在于，步骤如下：

a、PCR扩增具大肠杆菌密码子偏好性的改良肽LF-6目的基因；

b、利用pTWIN1载体和改良肽LF-6目的基因构建改良抗菌肽LF-6的重组表达质粒及相应的克隆菌株；

c、鉴定阳性转化子，亚克隆至大肠杆菌表达菌株；

d、挑单克隆阳性大肠杆菌表达菌株接种至摇瓶，诱导表达后收集菌液，超声破碎离心获得含融合蛋白的上清；

e、对含融合蛋白的上清进行在柱纯化与LF-6的切割释放及进一步通过RP-HPLC分析制备与质谱鉴定；

f、对纯化所得抗菌肽LF-6进行抑菌活性验证。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中改良肽LF-6的氨基酸序列为：KWRQWQSKWRRTNPWFWIRR（SEQ ID NO:1 ），依据大肠杆菌的密码子偏好性对其对应的密码子进行优化后的基因序列为：AAGTGGCGTCAGTGGCAGAGCAAATGGCGTCGCACCAACCCGTGGTTTTGGATTCGCCGC（SEQ ID NO:2 ），在LF-6目的基因前后两端设计与表达载体对应的限制性酶切位点 NdeI 和SpeI序列,为提高双酶切效率，在NdeI序列前和 SpeI序列后分别设计保护碱基 GGGAATTC,CC,设计合成了两条引物 F1和R1：

F1:5- GGGAATTCCATATGAAGTGGCGTCAGTGGCAGAGCAAATGGCGTCGCA -3（SEQ ID NO:3 ）； 

R1:5- GGACTAGTGCATCTCCCGTGATGCAGCGGCGAATCCAAAACCACGGGTTGGTGCGACGCCATTTGCTCTGC -3（SEQ ID NO:4）；利用重叠区基因扩增拼接法进行PCR扩增LF-6目的基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中，pTWIN1载体与 PCR扩增的改良肽LF-6目的基因PCR 回收产物分别经 NdeI,SpeI 双酶切后，在T4 DNA连接酶的作用下将目的片段构建至载体 pTWIN1相应多克隆位点，得到pTWIN1-LF-6-intein2-CBD的重组质粒，热激转化至E.coliDH5α感受态细胞，获得的阳性转化子经菌落PCR后用于测序分析。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤c中，测序正确的大肠杆菌表达菌株进行扩大培养，提取质粒，热激转入感受态E.coli BL21(DE3)pLysS中，在含有1%氨苄（AP）的抗性平板中筛选阳性克隆，挑阳性单克隆接种至含1% AP的LB培养基，活化后制备成甘油菌保种于-80℃备用。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤d中所述，配制1%的AP抗性平板，涂板甘油菌BL21(DE3)-pTWIN1-LF-6-intein2-CBD于平板上，将长出的单克隆接种至含1%AP的LB培养基中过夜活化，次日再按1%接种量接种至已提前灭菌的含有200mlLB培养基的1L摇瓶中，共 5 瓶1L发酵液，37℃，250rpm 培养，菌体长至OD600≈0.5时每瓶加入诱导剂IPTG 20μl至终浓度为0.1mM，调整温度转速分别为30℃，180rpm诱导3h, 4℃，10000g,离心10分钟收集菌液，用 Buffer1：20mM Tris-HCL,1M NaCl,1mM EDTA,pH8.0，0.1%吐温20清洗，10000g离心 5分钟，重复清洗一次，然后以原培养体积 1:50 的比例加入Buffer1彻底重悬菌液，冰上超声破碎，14800g 离心 30分钟，收集上清液过0.45微米滤膜除杂后冻存于-40℃用于下一步纯化使用。