[发明专利]抗菌肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，特别是涉及一组改建的抗菌肽及其制备方法和用途。具体的说是涉及一种通过氨基酸替换手段对猪乳铁蛋白肽LFP-20进行分子改建，优化获取两种抗菌活性更佳的改建抗菌肽LF-2和LF-6，利用毕赤巴斯德酵母获得重组改建抗菌肽LF-6的研究。 

背景技术

传统抗生素的发现和应用为治疗感染性疾病提供了非常有效的途径，也显著提高了动物食品产品的数量。毫无疑问，抗生素代表了20世纪最重要的科学和医学发现(Gordon et al.,2005;McPhee et al.,2005)。尽管目前抗生素治疗仍然是应对人类及动物微生物感染的首选方法，但是，细菌对传统抗生素耐药性的产生及流行已经引起越来越多公众对健康问题的关注，也驱使科学家们开始寻找具有广谱高效、又不易诱导耐药菌株产生的新型抗菌剂。抗菌肽（antibacterial peptides，AMPs）分子量小、水溶性好、热稳定性较高、生物功能多样，有着与传统抗生素不同的杀菌机制，不易导致耐药菌株产生，是一种具有巨大发展潜力的抗生素替代品(Haug et al.,2007)。目前发现的动物抗菌肽已达一千多种，不同种类抗菌肽的抗菌谱、抗菌活性、作用机制甚至对正常细胞的毒性既有相似之处，也存在很大的差异(Blazyk et al.,2001)，使寻找更加广谱、高效、安全的抗菌肽成为广大科研工作者努力的方向。乳铁蛋白肽是来源于哺乳动物乳铁蛋白的一种阳离子抗菌肽，它不但具有抗菌肽的一般优点，还由于其本身是食品蛋白的一部分，对机体正常细胞毒性非常低，相对安全性好，是开发新型抗菌制剂的较为理想模板。 

1992年，Bellamy的研究团队发现牛乳铁蛋白（bovine lactoferrin，bLF）和人乳铁蛋白（human lactoferrin，hLF）在酸性条件下经胃蛋白酶水解后，其N端能够释放出一种小肽。它不仅保持了完整蛋白的抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长等生物学功能，甚至具有比LF更强的抗菌活性。这两种小肽分别被命名为人乳铁蛋白肽牛乳铁蛋白肽（bovine lactoferricin，Lfcin B）和（human lactoferricin，Lfcin H）(Bellamy et al.,1992)。研究表明，LF的直接杀菌活性与其N-端的Lfcins密切相关；Lfcins不但可以杀死细菌，对真菌、病毒和寄生虫都有杀灭作用(Orsi,2004)。Lfcin B和Lfcin H由于其广泛存在的宿主防御特性收到了广泛关注。 Lfcins具有广谱的抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性，还显示出了抗真菌活性(Wakabayashi et al.,1996)。 

猪乳铁蛋白肽（LFP-20）是来源于猪乳铁蛋白N端，由20个氨基酸残基组成的抗菌肽。为了研制一种能替代抗生素的新型安全的抗菌制剂，我们在前期针对来源于哺乳动物乳汁的生物活性物质——猪乳铁蛋白开展了一系列的研究；乳铁蛋白来源于乳汁，对动物没有毒性，相对安全性好，但其抗菌活性并不理想。 

发明内容

为了克服现有技术的不足，我们在对不同动物来源抗菌肽抗菌活性及安全性筛选的研究中发现，LFP-20的抗菌谱广、相对安全性好，是开发抗生素替代品的较为理想模板；但其抗菌活性不甚理想。因此，我们在分析猪乳铁蛋白LFP-20理化性质、空间结构的基础上，通过分子设计对LFP-20进行分子改建，获得了在抗菌活性及细胞毒性方面表现俱佳、且具有独特膜作用机制的改建抗菌肽LF-2、LF-6，研究了改建抗菌肽的体内抑菌效果，并利用基因工程手段对改良抗菌肽进行了重组表达。上述改建抗菌肽为开发安全、高效、新型抗生素替代品提供优秀候选对象和理论依据，利用基因工程技术制备改建抗菌肽的方法成本低且操作方法简单。 

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一组合成抗菌肽，其特征在溶血性、对真核细胞毒性等副反应尽可能不变或降低的基础上，通过局部氨基酸的调整来增强LFP-20的杀菌活性，并且易制备。 

LFP-20的序列如下：KCRQWQSKIRRTNPIFCIRR（SEQ ID NO：1）。 

LF-2的序列如下：KARQWQWKIRRTWPIFAIRR（SEQ ID NO：2）。 

LF-6的序列如下：KWRQWQSKWRRTNPWFWIRR（SEQ ID NO：3）。 

本发明所要解决的技术问题之二在于提供LFP-20及其改建抗菌肽的固相化学合成制备方法。 

本发明所要解决的技术问题之三在于提供抗菌肽的应用。