[发明专利]利用蓝藻生产异戊二烯

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及利用蓝藻生产异戊二烯的方法。

背景技术

异戊二烯是重要的大宗基础原料，主要用于合成异戊橡胶，以用于制造轮胎。同时用于生产甲基庚烯酮、薰衣草醇等多种精细化工产品。还用于生产集成电路用的光刻橡胶以及合成润滑油添加剂等。此外，最近的研究表明异戊二烯还可以转化成生物燃料，如航空燃料。

目前，工业上异戊二烯主要用石油基原料生产，即利用溶剂萃取蒸馏法分离炼油副产物中的C5馏分。该制备方法费用高且异戊二烯的纯度低，随着化石资源的日益短缺、石油价格的不断上涨，预计异戊二烯的生产供应将受到限制、成本将进一步提高。还有通过化学合成异戊二烯，如丙酮和乙烯反应，丙烯聚合等，但同样面临着效率低，纯度低，成本高的问题。另一方面，随着世界经济的发展，轮胎的需求量不断的增加，而天然橡胶的的生产由于种植土地有限、病虫害等原因受到限制，导致异戊二烯的需求量呈现快速增长。因此，迫切需要开发出一种高纯度、低成本的异戊二烯制造技术。

异戊二烯是种类繁多的萜类化合物的组成单体。目前发现的异戊二烯的生物合成途径有两条（图1）：（1）甲羟戊酸（MVA）途径，以三个乙酰辅酶A分子为原料，形成甲羟戊酸，继而经过焦磷酸化，脱羧化合成异戊二烯基焦磷酸（IPP），再经过异构，形成二甲丙烯基焦磷酸（DMAPP），DMAPP在异戊二烯合成酶（isoprene synthease）的作用下生成异戊二烯。（2）磷酸甲基赤藓糖（MEP）途径，以丙酮酸和三磷酸甘油醛为原料，形成脱氧木酮糖-5-磷酸，还原异构生成甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP），继而经过一系列的反应生成羟甲基丁烯-4-磷酸（HMDPP），再在HMDPP还原酶的作用下同时生成IPP和DMAPP，DMAPP在异戊二烯合成酶的作用下生成异戊二烯。

目前仅有植物来源的异戊二烯合成酶基因（ispS）克隆和鉴定出来，分别来自杨树（Populus alba;Populus tremloides）（Mliter et.al.Planta2001213:483-487;Sasaki et.al.FEBS Letters579(2005)2514-2518）和葛藤（Kudzu）（Sharkey et.al.Plant Physiology137(2005)700-712）。植物在特定环境条件下（如热胁迫等）会释放异戊二烯，但收集植物释放的异戊二烯非常困难，效率低，而且植物生长缓慢，所以远远不能满足需求。

近年来随着代谢工程和合成生物学技术的迅速发展，利用微生物发酵法生产萜类化合物取得重大进展。美国Genencor公司通过遗传改造大肠杆菌BL21（E.coli BL21），获得高产异戊二烯工程菌。具体来说，向大肠杆菌中导入改造后的杨树来源的异戊二烯合成酶（IspS），进而导入外源的MVA途径、并且过表达磷酸葡萄糖酸内酯酶，最后通过发酵条件的优化，使异戊二烯的产量达到60g/L。然而，大肠杆菌发酵法合成异戊二烯，需要消耗大量的葡萄糖和淀粉。

蓝藻等光合微生物能够通过光合作用固定空气中的CO₂，在光生物反应器中较快生长。因此通过对蓝藻进行基因工程改造，将CO₂直接生物转化为异戊二烯，不仅能够降低底物成本，还可以减少CO₂的排放，因而具有重要的现实意义。Melis et.al.首次在聚胞藻（Synechocystis）中成功表达了葛藤来源的异戊二烯合成酶，并检测到异戊二烯的合成，但产量（50μg/L）很低，远远不能满足工业化生产的要求。

发明内容

为了解决现有的异戊二烯的生产方法中存在的产量低、成本高的缺陷，本申请的发明人通过比较蓝桉、杨树、葛藤等不同来源的异戊二烯合成酶，并且对其进行密码子优化后在聚胞藻中表达，进一步通过对异戊二烯合成途径的代谢流量的优化，结果显著地提高了聚胞藻基因工程菌合成异戊二烯的产量。

因此，本发明的目的在于提供多种利用蓝藻生产异戊二烯的方法。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一个方面，一种利用蓝藻生产异戊二烯的方法，在蓝藻中表达来源于蓝桉的异戊二烯合成酶编码基因。

根据本发明的优选实施例，所述来源于蓝桉的异戊二烯合成酶编码基因具有如SEQ ID NO：50所示的核苷酸序列。