[发明专利]谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。

背景技术

DAHP合成酶是代谢流向芳香族氨基酸的第一个关键酶，编码基因为AroI，它催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和四磷酸赤藓糖(E4P)合成3-脱氧-D-阿拉伯-7磷酸庚酮糖(DAHP)，进而生成分支酸，分支酸在色氨酸操纵子和其他酶的共同参与下最终转化为色氨酸，并分泌到胞外。随着分子生物学技术的飞速发展，在蛋白质定向进化技术和基因克隆表达方法相结合的基础上，使得催化活性提高的DAHP合成酶突变基因等位替换到基因组或在工程菌中过量表达成为可能，使代谢流向有利于色氨酸合成的方向，从而提高色氨酸产量。

近年来，人们对大肠杆菌的DAHP合成酶研究较为深入，在NCBI结构数据库中已收录了该酶的晶体结构，David L等人对His180、Craig M等人对Cys61、Cys328分别做了定点突变，但催化活性都没有得到提高，国内复旦大学胡昌云等人确定了AroGL175Q、AroGL175A、AroGL175D、Phe209Ser突变体酶催化活性分别提高1.33倍、1.57倍、1.65倍、1.8倍，而对工业上生产氨基酸的主要菌种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的研究鲜见报道，唯有Liao H-F等人报道Ser187对该酶的变构效应起到重要的作用。大肠杆菌的DAHP合成酶AroG基因150-189位与谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶Aro I基因158-197氨基酸高度保守，推断谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶L183Q突变体对该酶的催化活性也会有所提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供了一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。

为解决上述技术问题，本发明通过以下方案来实现：谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法，所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG-332，大肠杆菌DH5α；

所述谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆，该基因克隆步骤如下：

1)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，谷氨酸棒杆菌LG-332单菌落接种于10ml LB液体培养基中，30℃摇床培养12h，次日2％接种量接入100ml LB液体培养基；

2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成，根据GENE BANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 DAHP合成酶基因(aro I)核苷酸序列(GeneID：1018979)及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物：上游引物P1：5’-TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCA CTCGAAA-3’；下游引物P2：5’-TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC-3’，其中下滑线部分为Nde I和Xho I酶切位点；

3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增，以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，进行降落PCR扩增：以P1，P2为引物，反应条件采用热启动PCR方式：95℃预变性4min，80℃pause加入Primer starHS酶，之后94℃30s，60℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，58℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，56℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，54℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，52℃40s，72℃120s2个循环；94℃30s，50℃40s，72℃120s20个循环后；72℃延伸20min补加0.5μl Ex Taq酶加A尾，反应结束后取5μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

4)、PCR产物的回收，采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于-20℃，目的片段与克隆载体的连接，将回收的PCR产物连接到pMD18-T-simple载体上，连接反应中各种反应组分及加样量重量比分：回收的PCR产物4.5，pMD18-T-simple载体0.5，SolutionI5，总体积10，在16℃连接过夜，用CaCl₂法制备DH5α感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞；

5)、重组质粒的转化和阳性克隆的筛选；

6)、重组质粒的鉴定，采用碱裂解法提取质粒DNA，进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定；