[发明专利]一种巨龙竹不同类型种源分子标记鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种种源鉴定方法，具体涉及一种基于SSR分子标记鉴定巨龙竹秆型的方法。

背景技术

巨龙竹（Dendrocalamus sinicus Chia et J. L. Sun）是世界上目前已知最高大的竹种，特有分布于滇南、滇西南的局部区域，具有较高的经济价值。巨龙竹种质资源分为秆形特征基本稳定2个明显不同的变异类型，即竹秆弯曲、歪扭，竹节变形、缩短的弯曲型巨龙竹和节间正常、节部平滑，竹秆通直、分枝高而少的通直型巨龙竹。

造成巨龙竹秆形差异的原因，主要是遗传因素（杜凡等，巨龙竹的变异类型及其引种区划的研究，2001，竹子研究汇刊，20（1）：19-21）。分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反应。目前,分子标记技术已成为揭示植物种内遗传变异广泛应用的技术。

简单序列重复（single sequence repeat）简称SSR或微卫星（microsatellite）序列，大量地存在于大多数真核生物及部分原核生物基因组的非编码区和编码区中，由串联的1-6 个核苷酸重复片段构成，长度一般在100bp 以下，具有长度的可变性。简单重复序列分布于巨龙竹整个基因组的不同位置上，不同表现型个体间每个位点上重复单位数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列的两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因而可根据其两端的序列设计双向引物。

通直型巨龙竹秆形特征是竹材工业化利用的优良指标，而弯曲型则不宜工业化利用。由于巨龙竹生长范围狭窄，当前有关巨龙竹的研究手段和方法相对落后。目前，还没有公开文献资料发表关于巨龙竹种源鉴定的方法。因此，发明一种可以鉴定遗传稳定的通直型优良种源的方法是当前巨龙竹推广栽培所急需解决的问题。

发明内容

本发明旨在提供一种能快速、准确的鉴定巨龙竹种源类型的SSR分子标记方法。为实现本上述目的，本发明提供了如下技术方案，包括以下步骤。

（1）SSR引物筛选：从发明人前期设计的115对巨龙竹SSR引物中筛选特异性引物。

（2）选取拟鉴定的巨龙竹样品叶片，采用改进的CTAB法提取总DNA。

（3） 用筛选出的引物分别对样品DNA模板进行PCR扩增。

（4）检测PCR扩增产物的有效性和特异性。

（5）用扩增效果良好的PCR产物上毛细管电泳，检测等位基因类型。

（6）根据巨龙竹的基因型与秆型的相关性，确定样品的秆型。

上述方法，步骤（1）所述的特异性引物的要求是，等位基因类型在通直型和弯曲型个体之间有显著多态性，即等位基因类型不同时为纯合子或杂合子，特异性好，没有明显杂峰。筛选出的5对SSR特异性引物，其核苷酸序列如下表1。

上述方法，步骤（3）所述的PCR扩增反应，采用如下反应体系：

20μl体系，包含10μL2×Taq PCR MasterMix，正反引物（5ng/μl）各0.32μl，DNA(50ng/μL)0.6μl,补足ddH₂O至20μl。

上述方法，步骤（3）所述的PCR扩增反应，采用如下反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，引物退火温度退火40s，72℃延伸50s，运行35个循环；72℃延伸7min，4℃低温保存。

上述PCR反应程序，每对引物退火温度如下表2。

上述方法，步骤（4）所述的PCR扩增产物的检测采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；有效性是指，有扩增产物；特异性是指，扩增产物只有1到2条清晰的条带。

上述方法，步骤（5）所述的毛细管电泳采用QIAxcel毛细管电泳系统。

上述方法，步骤（6）所述巨龙竹的基因型与秆型的相关性，即不同基因型与两种秆型之间的对应关系，如下表3。

注：上述鉴定方法，当出现5对引物同时鉴定有差异情况，规定占多数的鉴定结果即为该样品最终的鉴定结果。

有益效果：本发明提供的SSR分子标记鉴定方法稳定可靠，不受巨龙竹生长环境的影响。并将巨龙竹的SSR片段多态性与秆型联系起来，可以准确筛选和鉴定巨龙竹优质种源。同时使用毛细管电泳的方法可以简便、快速、高通量地应用于巨龙竹通直型优质种源鉴定。 

附图说明

图1：引物Den006扩增弯曲型样品的毛细管电泳峰图。

图2：引物Den006扩增通直型样品的毛细管电泳峰图。