[发明专利]一种检测乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下成分：

PCR试剂盒A组试剂： 

PCR反应液A:PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP 

HBV-A1上游引物      5′- gttta  aagac  tggga  ggagt - 3′   

HBV-D公用下游引物  5′- agcca  cccaa  ggcac  agctt  g - 3′  

HBV-Y荧光探针: 5′-FAM-tgtag  gcata  aattg  gtctg tt - TAMARA-3′；

PCR试剂盒B组试剂： 

PCR反应液B:PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP  

HBV-B1上游引物    5′- tgggg  gagga gatta  ggtta at - 3′  

HBV-B2上游反义引物    5′- tttaa  cctaa  tctcc  tcccc  ca-3′  

HBV-D公用下游引物   5′- agcca  cccaa  ggcac  agctt  g -3′

HBV-Y荧光探针: 5′-FAM-tgtag  gcata  aattg  gtctg tt - TAMARA-3′；

PCR试剂盒C组试剂： 

PCR反应液C:PCR缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP  

HBV-C1上游引物       5′- ggagg  agatt  aggtt  aaaga- 3′     

HBV-C2上游反义引物   5′- ccttt  aacct  aatct  cctcc- 3′    

HBV-D公用下游引物    5′- agcca  cccaa  ggcac  agctt  g - 3′  

HBV-Y荧光探针: 5′-FAM-tgtag  gcata  aattg  gtctg tt - TAMARA-3′。

2.根据权利要求1所述的一种检测乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的试剂盒，所述成分的浓度为：

PCR反应液A：PCR缓冲液（1×）、TaqDNA聚合酶1.5U、dNTP   0.3 μmol/L：

HBV-A1上游引物      5′- gttta  aagac  tggga  ggagt - 3′   0.3 μmol/L

HBV-D公用下游引物  5′- agcca  cccaa  ggcac  agctt  g - 3′   0.3 μmol/L

HBV-Y荧光探针: 5′-FAM-tgtag  gcata  aattg  gtctg tt - TAMARA-3′；0.2 μmol/L；

PCR反应液B：PCR缓冲液（1×）、TaqDNA聚合酶1.5U、dNTP  0.3 μmol/L

HBV-B1上游引物    5′- tgggg  gagga gatta  ggtta at - 3′  0.3 μmol/L

HBV-B2上游反义引物    5′- tttaa  cctaa  tctcc  tcccc  ca-3′  0.03 μmol/L

HBV-D公用下游引物   5′- agcca  cccaa  ggcac  agctt  g -3′；0.3 μmol/L

HBV-Y荧光探针: 5′-FAM-tgtag  gcata  aattg  gtctg tt - TAMARA-3′；0.2 μmol/L；

PCR反应液C：PCR缓冲液（1×）、TaqDNA聚合酶1.5U、dNTP 0.3 μmol/L

HBV-C1上游引物       5′- ggagg  agatt  aggtt  aaaga- 3′   0.3 μmol/L

HBV-C2上游反义引物   5′- ccttt  aacct  aatct  cctcc- 3′    0.03 μmol/L

HBV-D公用下游引物    5′- agcca  cccaa  ggcac  agctt  g - 3′  0.3 μmol/L

HBV-Y荧光探针: 5′-FAM-tgtag  gcata  aattg  gtctg tt - TAMARA-3′  0.2μmol/L。

3.权利要求1所述的一种检测乙肝病毒核心基因启动子碱基突变的试剂盒，其检测方法为：

1）样本DNA处理：取待测血清样本30μl 加入等量DNA提取液60μl混匀，95-98℃ 8-9分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟, 12000rpm离心5分钟，取上清液离心备用；

2）PCR反应液分装：各取PCR反应液A、B和C各25μl,取待测检测提取HBV DNA上清液5μl加入各反应管，每份样本需同时用PCR反应液A和B两支反应管检测；

3）PCR扩增：取分装好PCR反应液的各反应管，按以下PCR扩增条件设置并扩增：94℃ 3分钟预变性，然后93℃ 40秒-55℃ 60秒循环40次；

4）检测结果与判断：

（1）应用PCR组试剂盒A组试剂检测乙肝病毒核心基因启动子DNA的判断: 

DNA检测阴性:CT值≥38； 

DNA检测阳性:CT值<36 ；

DNA检测灰区：36 <CT值<38,需重作一次，重做结果>36判断检测阴性；

（2）应用PCR试剂盒B组试剂检测乙肝病毒核心基因启动子A1762T碱基变异的判断: 

突变检测阴性:PCR反应液B管检测CT值≥38

突变检测阳性:PCR反应液B管检测CT值<36; 

DNA检测灰区：36 <CT值<38,需重作一次，重做结果>36判断阴性；

（3）应用PCR试剂盒C组试剂检测乙肝病毒核心基因启动子G1764A碱基变异的判断: 

突变检测阴性: PCR反应液C管检测CT值≥38；

突变检测阳性: PCR反应液C管检测CT值<36;

DNA检测灰区：36 <CT值<38,需重作一次，重做检测结果>36判断阴性。