[发明专利]检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载方法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种离体鼠胫骨骨细胞实时钙信号检测技术，用于研究骨力学信号转导和骨适应的相关机理，为临床骨质疏松症的病因学和治疗学的研究提供更深入而科学的理论依据。

背景技术

骨质疏松症（OP）是临床上最为常见的疾病之一，表现为骨量的降低、骨组织的微结构衰退以及骨脆性的增加，常导致骨折的发生及肢体功能永久性丧失。随着我国人口老龄化速度的加剧，OP给我国带来的经济和社会负担也逐年加重。

19世纪著名的Wolff定律提出：骨骼作为机体的应力承载系统，其能够通过改变自身的结构以对外界应力刺激作出适应性改变，而OP发生的主要原因之一就是骨骼上的应力负荷不足或骨骼自身应力响应能力衰退，造成骨钙大量丢失，进而诱发OP。但是，这种骨适应原理的具体发生机制目前仍未彻底阐明，骨组织是如何响应、转导外界应力刺激的，目前仍不得而知。骨细胞（OCY）是成骨细胞（OB）的终端分化细胞，约占骨中细胞总数的95%，它们沉积在骨矿化基质中，彼此相连形成OCY细胞网络。OCY细胞网络是响应外界力学刺激的主要组件，OCY能响应外界的应力刺激从而调控OB和破骨细胞（OC）的生物活性和功能。因此，深入研究OCY力学信号响应及转导的机制，对于进一步揭示骨适应的机制，深入了解OP的发生机理具有重要的意义。

钙信号是机体中最重要的第二信使分子，它可以将细胞外的信号传导入细胞内，从而调控细胞的各种生理功能，包括增殖、分化及凋亡等。同时，钙信号也是最重要的力学信号转导分子，已被发现是多个机体组织内在应力刺激下最早发生变化的信号转导分子。目前，国际上研究应力刺激对于骨细胞钙信号响应的方法主要采用体外实验的方法，即在细胞表面施加应力的刺激，包括流体剪切力、细胞压痕、基底拉伸等。但是，体外细胞实验无法真实的模拟骨细胞的原位生长环境，同时体外骨细胞分离培养也很难保持其生物学特性与其在体环境中的完全一致。因此，能够实时的监测原位细胞内钙信号并深入研究其特征对于研究细胞力学信号转导有着十分重要的意义，它相比于体外细胞钙信号研究具有更加明显的优势。目前国内外尚未见研究报道。在动态的应力载荷作用下，会引起组织发生压缩和弯曲形变，而即使极其细微的形变也会引起激光共聚焦焦距的显著偏移。因此，原位骨细胞钙信号应力转导的主要技术挑战在于如何在周期载荷的作用下克服组织在显微镜下的焦点偏移。

发明内容

本发明针对上述周期载荷作用下原位骨细胞钙信号研究存在的技术挑战，提出了一种离体鼠胫骨骨细胞钙信号实时检测的方法及装置，该方法采用激光共聚焦采集和应力加载同步的技术，能够显著抑制周期载荷作用引起的激光共聚焦显微镜焦点偏移，从而能够精确采集和测量原位骨细胞钙信号响应。

为达到以上目的，本发明是采取如下技术方案予以实现的：

一种检测离体鼠胫骨钙的激光共聚焦同步应力加载方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）将标记有Fluo-8AM钙荧光探针的鼠胫骨固定于一个腔室中的组织固定器中间，腔室内填充以37℃细胞培养液淹没该鼠胫骨，将一个激光共聚焦显微镜镜头对着于腔室下面的石英晶片，使胫骨前内侧平坦区域的钙离子在激光共聚焦显微镜中成像，组织固定器的一端固定，另外一端施以应力加载作用于鼠胫骨产生轴向的压缩载荷，使胫骨前内侧的钙成像表面同时产生轴向的压缩形变和垂直于轴向的弯曲形变；

（2）激光扫描共焦显微镜每5秒进行一次面扫描，共进行180帧的图像扫描，其中前5帧的采样作为基线控制；

（3）应力加载开始于第5帧和第6帧扫描的间歇，采用周期动态加载方式，基本波形为斜坡加载，包括2-N的预加载，0.5秒的斜坡上升以及0.5秒的斜坡下降，通过控制加载的速率分别产生斜坡尖峰为8-N的加载波形，两个加载周期之间的滞留时间为4秒，共加载175周期。

上述方法中，所述的激光扫描共焦显微镜每5秒进行一次面扫描包括1.1秒的扫描时间以及3.9秒的间歇时间。所述每个加载周期中的斜坡上升位移及斜坡下降位移相等。