[发明专利]一种醇脱氢酶在催化生成(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种醇脱氢酶的应用，尤其涉及一种醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)在以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物不对称还原反应生产(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用。 

背景技术

(R)-4-氯-3羟基丁酸乙酯（Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate， (R)-CHBE）是一种重要的有机中间体，可用于很多活性药物的合成，如(-)-大内酰亚胺A((-)-macrolactin A)、L-肉碱(L-carnitine)和R-Y-氨基-β-羟基丁酸(GABOB)的关键手性中间体^[1,2]。 

以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl COBE)作为还原反应的潜手性底物，易于合成且价格低廉，以其为底物进行不对称还原反应获取(R)-CHBE是非常经济有效的制备途径。 

迄今为止关于COBE不对称还原制备手性CHBE已进行了很多的研究报道。概括起来主要有化学法和生物法。 

化学催化不对称还原法，所用催化剂包括价格昂贵的铑、釕等金属，采用化学法合成手性CHBE的缺点是产物的光学纯度不够高，且催化还原反应需要很高的氢气压，耗能高，污染大^[3]。 

微生物法分为酶催化和全细胞催化法，全细胞法则分为采用野生酵母和基因工程菌催化COBE为(R)-CHBE两种。许多微生物都能还原COBE,但绝大多数微生物的还原产物是S构型的,只有少数微生物能获得R型还原产物,如赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor) 、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa) 、卡斯太拉德巴利酵母(Debaryomyces castellii)及掷孢圆酵母(Torulaspora nagoyaensis)等，但产物的手性选择性即对映体过量(ee) 值只有8%～63%^[4,5]。采用野生酵母进行催化所获得的产物的光学活性往往很低，需要筛选到高立体选择性的优良微生物菌株非常困难，所以近来的研究着重集中于运用重组大肠杆菌不对称合成具有高立体选择性的(R)-CHBE。Hiroaki Yamamoto等^[6]将来自于Candida parapsilosis醇脱氢酶基因在大肠杆菌E.coli W3110中表达，重组菌在水相体系中催化COBE不对称还原(辅底物为2-propanol),得到产物(R)-CHBE，光学纯度99% e.e。 Kataoka. M等^[7]醛基还原酶基因 (来自Sporobolomyces salmonicolor) 和葡萄糖脱氢酶基因 (来自Bacillus megaterium) 在大肠杆菌中共表达将此转化菌株的细胞用于在水/乙酸正丁酯两相体系中催化COBE的不对称还原。在定期添加辅酶NADP、葡萄糖和底物以及控制 pH 值的条件下，得到在有机相中的产物(R)-CHBE 浓度为268 g/L，摩尔转化率和产物的光学纯度分别为94.1%和91.7% e.e. 。 

综上所述，现有催化COBE为(R)-CHBE的技术存在底物得率低、产物光学活性低、成本高等问题。 

本专利中涉及到的还原酶是醇脱氢酶，其包含336个氨基酸，其在Genbank中的收录号为EEQ43320.1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/EEQ43320.1 )，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码该蛋白的基因含有1011 bp碱基 ，其在Genbank中的收录号为KC236900，(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KC236900 )其基因序列如SEQ ID NO：1所示。至今未发现该醇脱氢酶用于COBE不对称还原制备(R)-CHBE的报道。 

  

【参考文献】：

[1] Yan Q Ni, Jian-He Xu . Biocatalytic ketone reduction: A green and efficient access to enantiopure alcohols . Biotechnol Adv (2011)