[发明专利]一种产黄青霉形态突变高产菌的构建方法

权利要求书

1.一种产黄青霉形态突变高产菌的构建方法，其特征是由以下步骤组成：

（1）产黄青霉出发菌在菌丝液体培养基中培养，培养一段时间后提取产黄青霉全基因组；

（2）构建以几丁质合成酶基因为目的基因的干扰载体，并转化产黄青霉； 

（3）利用干扰载体对产黄青霉出发菌株进行干扰，获得形态突变高产菌株。

2.根据权利要求1所述的产黄青霉形态突变高产菌构建方法，其特征在于，具体操作步骤为：

（1）将产黄青霉在菌丝液体培养基中培养；

（2）提取产黄青霉全基因组；

（3）设计引物从产黄青霉全基因组中扩增目的形态基因片段；

    （4）分别将载体与目的基因片段用NcoI酶切后，在连接酶作用下连接成干扰载体，其中NcoI克隆位点位于两个方向相反的启动子之间；

    （5）干扰载体转化产黄青霉，利用载体上的抗性基因筛选转化子；

    （6）将突变株接入种子瓶中，培养一定时间后，取适量种子培养液，过滤收集菌丝，染色后用显微镜观察形态；

    （7）将培养一段时间的种子转接入发酵培养基培养，培养一定时间取样，过滤收集菌丝，染色后显微镜观察形态；

    （8）测定青霉素效价，筛选高产菌株。

3.根据权利要求2所述的产黄青霉形态突变高产菌构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述的菌丝液体培养基，其培养基组成成分（g/L）为：葡萄糖10-20、酵母提取物5-20、胰蛋白胨5-20、硝酸钠0.1-10、磷酸二氢钾 1-3、氯化钾 0.1-1、硫酸镁 0.1-1、葡萄糖10-20、酵母提取物5-20、胰蛋白胨5-20、硝酸钠0.1-10、磷酸二氢钾 1-3、氯化钾 0.1-1、硫酸镁 0.1-1、四水合氯化锰0.01-0.1、二水钼酸钠为0.01-0.1、玉米胚芽油0.01-0.1， 余量为水。

4.根据权利要求2所述的产黄青霉形态突变高产菌构建方法，其特征在于：步骤（2）中的产黄青霉全基因组的提取方法为：先收集菌体，再液氮研磨后用真菌DNA的提取试剂盒提取。

5.根据权利要求2所述的产黄青霉形态突变高产菌构建方法，其特征在于：步骤（3）中所述的目的形态基因片段，两侧加有限制性内切酶的酶切位点和保护碱基序列，片段长度为500 bp左右。

6.根据权利要求2所述的产黄青霉形态突变高产菌构建方法，其特征在于：步骤（5）中干扰载体转化产黄青霉的方法为：采用聚乙二醇介导的原生质体转化、电转化或根癌农杆菌遗传介导方法转化产黄青霉。

7.根据权利要求2所述的产黄青霉形态突变高产菌构建方法，其特征在于：步骤（6）和（7）中采用的染色方法为乳酚棉兰染色或亚甲基蓝-石炭酸品红复合染色。

8.根据权利要求2所述的产黄青霉形态突变高产菌构建方法，其特征在于：步骤（8）中采用的效价测定方法为碘量法或者HPLC法。

9.根据权利要求2所述的产黄青霉形态突变高产菌构建方法，其特征在于：所述的干扰载体中含有一个腐草霉素抗性基因，一个氨苄抗性基因和一个dsRNA表达盒。