[发明专利]一种新的卵巢癌细胞株TRP14-A2780及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的卵巢癌细胞株TRP14-A2780，通过脂质体的转导和稳筛，在该细胞株中实现了对TRP14基因的稳定高表达。

背景技术

卵巢癌仍然是迄今致死率最高的妇科恶性肿瘤，根据美国国家健康统计中心2012年公布的数据，美国卵巢癌总的5年生存率为44％，其中晚期病例仅为27％（Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2012.CA Cancer J Clin.2012Jan;62(1):10-29.）。目前卵巢癌的主要治疗方式为肿瘤细胞减灭术和以铂类、紫杉醇为一线药物的联合化疗。大多数患者在治疗后2～3年内复发，几乎所有复发性卵巢癌对再次化疗耐药（Agarwal R,Kaye SB.Ovarian cancer:strategies for overcoming resistance to chemotherapy.Nat Rev Cancer2003;3:502-16.），导致卵巢癌高致死率的主要原因是由于多数患者在首次就诊时已经处于肿瘤的晚期以及初次治疗后复发、耐药。因此研究卵巢癌化疗耐药的机制对改善卵巢癌患者的远期疗效具有重要意义。

紫杉醇是一种促微管聚合和稳定，抗有丝分裂的细胞周期特异性药物。研究表明，与紫杉醇耐药相关的机制主要包括：P-糖蛋白等药物泵出蛋白表达增加，微管动态变化和tubulin同型分子表达改变，微管相关和细胞骨架调节相关蛋白阻碍紫杉醇和微管结合，纺锤体检查点蛋白BubR1及凋亡相关分子改变等（Kavallaris M.Microtubules and resistance to tubulin-binding agents.Nat Rev Cancer.2010Mar;10(3):194-204.）。但根据已有报道，各种针对这些靶点的阻遏方法仅能部分逆转卵巢癌耐药，事实上迄今尚没有一种基于上述机制建立的逆转耐药方法应用于临床。卵巢癌耐药的关键机制尚有待阐明。

申请人在前期研究中，通过药物浓度逐渐递增的紫杉醇的持续、长期作用，成功建立了紫杉醇耐药的卵巢癌细胞亚系SKOV3-TR30，其耐药指数较亲代SKOV3细胞增加27倍(Fu Y,Ye D,Chen H.et al.Weakened spindle checkpoint with reduced BubR1 expression in paclitaxel-resistant ovarian carcinoma cell line SKOV3-TR30.Gynecol Oncol.2007Apr;105(1):66-73.)。研究显示紫杉醇耐药的细胞株与其亲代细胞相比，除了耐药性增加之外，其他多种表型也可发生改变。为了进一步研究耐药细胞和亲代细胞间差异表达的蛋白，我们采用LC-MS/MS-based label-free定量蛋白质组学技术进行筛选，共发现356个差异蛋白，涉及细胞代谢、生化过程调控、物质运输、组织发生、细胞分化、死亡和信号转导等多个方面。其中部分差异蛋白可能参与了卵巢癌侵袭转移和细胞增殖、死亡等其他生物学行为的调控。进一步通过定量RT-PCR和Western Blot验证我们发现硫氧还蛋白相关蛋白14（TRP14）在耐药细胞中表达显著上调。

TRP14是一种广泛表达的可溶性的胞浆蛋白，最早从Hela细胞cDNA文库中成功克隆，相对分子质量为14KD，属于Trx蛋白家族新发现的一种二硫还原酶。但目前对于TRP14的功能所知甚少。仅有的研究提示TRP14参与肿瘤坏死因子α（TNF-α）信号途径的调控。采用RNA干扰部分下调TRP14的表达，可导致Hela细胞TNF-α诱导的核因子κB（NF-κB）活化，丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）途径激活，和细胞凋亡增加(Jeong WJ,Chang TS,Boja ES,et a1.Roles of TRPl4,a thioredoxin-related protein in tumor necrosis factor-alpha signaling pathways.J Biol Chem,2004,279(5):3151-3159.)。虽然TRP14对TNF-α的效应具有调控作用，但TRP14是否可改变卵巢癌细胞的化疗耐药性，目前未有报道。但一般瞬时质粒转染的短效性，在研究中需要多次转染，这无疑增加了人力投入及研究成本。构建该稳转细胞株可以直接用于检测实验研究中的指标，可避免多次重复转染，简化实验操作，节约实验时间和成本。

发明内容