[发明专利]一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌及其构建方法

权利要求书

1.一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌，其特征是，所述工程菌是以转属主粘虫颗粒体病毒PuGV-Ps增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌Bt为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV1将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因获得。

2.权利要求1所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是：

（1）PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆：室内人工饲养东方粘虫，以PuGV感染寄主，分离纯化获得PuGV-Ps，提取颗粒体病毒DNA，PCR扩增增强蛋白全长基因En；扩增基因En与克隆载体pET-15b经酶切连接并转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素LB平板筛选克隆子，酶切鉴定重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En；

（2）增效蛋白整合载体的构建：以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，扩增增效蛋白基因；以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTV1为载体，Saml酶切线性化连接扩增的增效蛋白基因后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子Top10-3，Xhol和Nhel双酶切鉴定增效蛋白基因的插入位点和方向，获得增效蛋白基因整合载体pLTV1-En；

（3）苏云金杆菌感受态细胞的制备及整合载体的转化：LB液体培养基接种苏云金杆菌活化，以LB+0.5M山梨醇为培养基转接培养制备苏云金杆菌感受态细胞；Top10-3菌中提取增效蛋白基因整合载体pLTV1-En，电击法将整合载体pLTV1-En转化至苏云金杆菌感受态细胞，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子，获得转化子Bt-En-1；

（4）转化子的高温转接和筛选：将转化子Bt-En-1接种于LB培养液中，40-50℃培养并转接5-7次后涂氨苄青霉素LB平板产生单菌落，分别点种在氨苄青霉素单抗平板和无抗平板的对应位置，置28-30℃培养48h后，挑选无抗培养基中失去抗性的单菌落，显微镜镜检是否产生伴胞晶体蛋白，再通过提取质粒和PCR扩增，最后得到染色体重组增效蛋白苏云金杆菌工程菌Bt-En。

3.根据权利要求2所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是，步骤（1）中所述提取颗粒体病毒DNA，PCR扩增增强蛋白全长基因En的方法为：碱裂解酚抽提法提取 PuGV-Ps DNA用作模板, 设计上游引物：5’- GC CAT ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GC T-3’ ，下游引物：5’- GC CTC GAG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CAT T -3’，引入Nde I、Xho Ⅰ两个酶切位点，PCR扩增PuGV-Ps增效蛋白基因；PCR扩增的反应条件：先94 ℃预变性4 min，然后依次94 ℃变性30 sec、56 ℃复性30 sec、72 ℃延伸3 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min；琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。

4.根据权利要求2所述的染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法，其特征是，步骤（2）中所述以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，扩增增效蛋白基因为：以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，设计上游引物：5’-AG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GCT-3’；下游引物：GT CGA CTC TAG AGG ATC CCC GGG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CATT，上下游引入Smal酶切位点，PCR扩增增效蛋白基因，PCR扩增反应条件：先95 ℃预变性5 min，然后依次97 ℃变性30 sec、55 ℃复性30 sec、72 ℃延伸3 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min；琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。