[发明专利]一种可溶性重组胰岛素及其衍生物的表达方法及其应用

说明书

一、技术领域：

本发明属于生物技术领域。具体涉及一种可溶性重组胰岛素及其衍生物的表达方法及其应用。

二、背景技术：

在现代社会，糖尿病是一种发病率高、并发症多且难以根治的慢性疾病。在世界范围内，糖尿病发病率都在上升。这种疾病是导致失明、肾衰竭、截肢、心脏病和中风的主要原因。每年因它之而丧命的患者人数与因艾滋病病毒/艾滋病 (HIV/AIDS) 而导致的死亡人数不相上下。目前，我国可能已成为糖尿病患病人数最多的国家，我国糖尿病成人患者总数达9240万，其中农村4310万，城市4930万左右，发病率超过了10%，糖尿病用药市场已过百亿元。

胰岛素类药物是控制和治疗糖尿病的不二选择。按来源分类，有动物胰岛素、半合成人胰岛素和生物合成人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）；按药效时间长短又可分为超短效、短效、中效、长效、预混胰岛素。据不完全统计，胰岛素市场容量也近60亿元，同时每年增速超过20%。2010年，中国已经成为全球糖尿病患病率增长最快的国家之一，增速惊人。仅诺和诺德一家，2009年在中国市场的胰岛素销量就已经超过了40亿元，这个市场不可限量。但国内企业从这个大蛋糕中只分食到5%的份额。据统计，外资企业占据了中国胰岛素市场95%的份额，而在重组人胰岛素方面，只有通化东宝和甘李药业两家涉足，其主要瓶颈在于胰岛素及其衍生物生产工艺的高难度。

胰岛素及其衍生物分子量 6063，由两条氨基酸肽链组成。A 链有 21个氨基酸，B 链有 32 个氨基酸。A-B 链之间有两处二硫键相连，A 链自身有一对二硫键相连。虽然胰岛素及其衍生物已投入生产，但是其纯化步骤繁琐、产量较低的问题一直成为影响胰岛素及其衍生物成本的关键难题。

在经典的原核表达体系中，胰岛素及其衍生物由于两对二硫键的存在，常以不溶性的包涵体形式存在。由于大肠杆菌硫氧还蛋白（Trx）具有在大肠杆菌中表达水平高、可溶性能好等特点，已经被美国Novagen公司开发成为一个常用的融合表达标签（pET32系列表达载体），用于提高目标蛋白的可溶性，并且取得了较广泛的成功应用。已经有科学家尝试将人胰岛素与硫氧还蛋白（Trx）融合表达（张守涛等人，生物技术，2010,20(2):14-16；董文甫等人，草食家畜, 2006，4:4-6），但实验结果表明：硫氧还蛋白（Trx）融合表达的胰岛素可溶性依然较差。例如，重庆理工大学范开等人2006年发明的可溶性胰岛素生产工艺将Trx置于胰岛素的N端，在胰岛素A、B链之间放置了C肽，因此，在产物后加工工艺环节，既需要切除N端的Trx蛋白，又需要切除胰岛素A、B链之间的C肽，由于使用了具有分子伴侣性质的Trx蛋白质，胰岛素的表达水平为20%，可溶性的胰岛素占细菌总蛋白的15%。大部分表达的重组胰岛素仍然以包涵体形式存在。

因此，对于重组胰岛素及其衍生物的生产来说，由于去除C肽的后加工环节已经成熟，包涵体复性的效率及其成本已经成为重组胰岛素及其衍生物生产的关键和瓶颈环节。有效避免重组胰岛素及其衍生物蛋白质在细菌中表达时包涵体的形成，这是国际重组胰岛素及其衍生物行业至今缺乏重大进展的难题。

三、发明内容：

为了有效避免克服重组胰岛素及其衍生物生产过程中存在的包涵体复性效率及其成本的难题，本发明的目的在于提供一种全新的重组胰岛素及其衍生物在大肠杆菌中可溶性表达的新的表达方法，用于制备重组胰岛素及其衍生物。

为达到上述目的，本发明的技术方案是用Trx代替C肽，将Trx作为胰岛素及其衍生物A、B链之间的连接肽使用的一种重组胰岛素及其衍生物在大肠杆菌表达系统中表达方法。

进一步地，上述用Trx代替C肽，将Trx作为胰岛素及其衍生物A、B链之间的连接肽使用的一种重组胰岛素及其衍生物在大肠杆菌表达系统中表达方法，使Trx兼具胰岛素C肽和可溶性融合标签的双重功能，从而能够改善重组胰岛素及其衍生物表达产物的可溶性表达。

进一步地，上述重组胰岛素及其衍生物与多分子伴侣共表达的表达方法，从而显著提高重组胰岛素及其衍生物表达产物的可溶性表达产量。

进一步地，一种在低温下（10-35℃）表达上述重组胰岛素及其衍生物的方法。

进一步地，一种利用锌离子金属亲和层析纯化上述重组胰岛素及其衍生物的方法，但是并不局限利用锌离子金属亲和层析纯化上述重组胰岛素及其衍生物的纯化方法。