[发明专利]一种麻疯树叶柄外植体直接再生不定芽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种麻疯树叶柄外植体直接再生不定芽的方法。

背景技术

伴随着全球对化石燃料的需求日益增长，存储的化石燃料即将耗尽，人们越来越关注可再生的生物柴油。在可产生生物柴油的候选植物中，属于大戟科的麻疯树（Jatroha curcas L.）具有明显的优势，它的种子含油量高，种仁含油量可达40%~60% ，同时，麻疯树油中含有活性成分多，如毒蛋白、麻疯酮等有着重要的农药和医药价值。

然而，大力推广麻疯树的种植却面临一系列问题，虽然麻疯树种子中含油量高，但种子产量不高；种油中活性成分多，但仍需要改变油的成分才能直接替代化石燃料；麻疯树对环境要求较高，耐寒能力弱，分布区域较窄。麻疯树属包括175个种，可以通过种间杂交引入优良性状，但所需周期长，不能够获得特异的外源基因，故主要通过基因转化改变遗传背景。高频率的植株再生体系是基因转化的基础。

在以麻疯树叶柄作为外植体诱导不定芽再生时，通常是在麻疯树叶柄外植体不定芽再生培养基中添加细胞分裂素，而最常用的细胞分裂素为6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），浓度为1~2 mg/L；6-糠氨基嘌呤（6-KT），浓度为0.1~1.0 mg/L或苯基噻二唑基脲（TDZ），浓度为0.05~0.5mg/L。在这种条件下叶柄外植体的不定芽再生效率很低，芽体的质量也较差。同时，这些再生体系均存在周期长（80 天以上）、再生率不高的问题，严重制约了麻疯树遗传转化研究的开展。

发明内容

本发明为了克服现有技术麻疯叶柄树外植体再生不定芽时再生率低、再生芽体质量差、再生周期长的缺陷，提供一种麻疯树叶柄外植体直接再生不定芽的方法。所述方法简便，可以显著缩短整个培养周期，而且通过所述的方法可以得到数量更多、质量更好的不定芽。

本发明通过以下技术方案予以实现上述目的：

一种麻疯树叶柄外植体直接再生不定芽的方法，包括如下步骤：

S1.取麻疯树叶柄进行切割获取叶柄外植体；

S2.将步骤S1中的叶柄外植体用苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理；

S3.将步骤S2处理后的叶柄外植体接种至无激素的培养基上培养。

优选地，步骤S2中所述苯基噻二唑基脲（TDZ）溶液浓度为0.5~12 mg/L。

更为优选地，所述苯基噻二唑基脲（TDZ）溶液浓度为2~6 mg/L。

最优选地，所述苯基噻二唑基脲（TDZ）溶液浓度为2 mg/L。

步骤S2的TDZ溶液采用一般方法配制成所需即可，具体地，可以采用如下方法配制：称取一定量的TDZ粉末，用1N NaOH 充分溶解，再用去离子水定容，采用1 N HCl溶液调整TDZ处理溶液的pH至5.8~6.0；使用前用0.22微米的水系滤膜对已配制好的TDZ处理溶液进行过滤灭菌。

    优选地，S2中所述浸泡处理的时间为3~80 min。

更为优选地，所述浸泡处理的时间为4~20 min。

最优选地，，所述浸泡处理的时间为5 min。

优选地，步骤S3中所述接种的方式为横放方式，即使叶柄外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直。

优选地，步骤S3中所述培养的条件为：光照强度为2000~2500 lx，光照时间为12~16小时/天，培养温度为25±1℃。

本发明的创造点在于先用高浓度的激素短暂处理，再用无激素的培养基培养再生不定芽，无激素培养基的种类对本发明来说不是着重点，只要是不含激素，而且能够为不定芽的再生提供充足营养成分的培养基都可以实现本发明。优选地，本发明步骤S3中所述无激素的培养基以无激素的MS培养基为主要成分。另外，所述无激素的培养基还含有25~35 g/L蔗糖、80~120 mg/L肌醇和6~8 g/L琼脂；培养基pH为 5.8~6.0。所述培养基并不限定本发明的保护范围。

传统麻疯树叶柄外植体不定芽再生培养方法之所以存在不定芽再生效率很低，芽体的质量差、周期长的缺陷，首先是因为长时间培养外植体不能够用高浓度的细胞分裂素，因为长期高浓度激素培养外植体将导致外植体受伤甚至死亡，而低浓度的细胞分裂素的刺激不定芽再生的作用又不够强。其次是在不定芽形成以后残存在培养基和外植体组织中的细胞分裂素对不定芽的进一步生长有十分不利的影响