[发明专利]抗中国对虾β整合素VWA结构域单克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）β整合素VWA结构域单克隆抗体及其制备方法，属于对虾分子免疫学技术领域。 

背景技术

整合素（Integrin）是广泛存在于细胞表面的一类粘附分子，它是由有一个α亚基和一个β亚基以非共价键结合形成的异二聚体，它主要介导细胞与细胞之间以及细胞与胞外基质之间的相互作用，参与调解细胞的增值、分化、粘附、迁移等过程，并在多种病理过程中发挥着重要的作用。VWA结构域是β-integrin胞外区重要的结构域，该结构域中存在一个金属离子依赖性粘连位点（MIDAS），它可以保守地与RGD模体发生特异性结合，因此在整合素与胞外基质相互结合中起得重要作用。目前研究发现，整合素能在多种病毒与宿主细胞相互作用的过程中发挥着重要作用，在腺病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、埃可病毒、汉坦病毒等多种病毒的粘附、侵入、信号传递等环节起关键作用。对虾白斑症病毒（WSSV）是目前造成我国对虾养殖业最严重的病毒性病原，严重制约了对虾养殖业的健康发展，至今仍没有有效的治疗方法。分子感染机理的研究直接关系着能否有效实现该病的预防和控制，成为当前该病研究的重点和热点，而WSSV受体研究是弄清分子感染机理的关键环节。目前研究证实对虾β-integrin与WSSV相互之间存在结合活性，且在WSSV感染中也起着重要作用。因此利用抗中国对虾β-integrin VWA结构域单克隆抗体一方面可以对β-integrin进行亚细胞定位，检测其在不同对虾及组织器官内的丰度水平，跟踪病毒黏附入侵动态，为弄清该蛋白在WSSV感染过程中作用机制，深入了解WSSV感染的分子机理提供了有力工具，为实现WSSV分子免疫预防控制有着极为重要理论和现实意义；另一方面该单抗能为β-integrin在对虾其他疾病病理过程及细胞增值、分化、粘附、迁移活动中功能机制的研究中发挥重要作用。 

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种抗中国对虾β整合素VWA结构域单克隆抗体，该抗体能与β整合素VWA结构域结合。 

本发明在另一个目的在于提供上述抗中国对虾β整合素VWA结构域单克隆抗体的制备方法。 

本发明的又一个目的在于提供一种抗中国对虾β整合素VWA结构域单克隆抗体在β整合素检测中的应用。 

本发明的第四个目的在于提供一种抗中国对虾β整合素VWA结构域单克隆抗体在干扰抑制β整合素与WSSV相互作用中的应用。 

本发明的任务是由以下技术方案实现的：研制了一种抗中国对虾β整合素VWA结构域单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株2C5，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏号为：CCTCC NO: C201041，保藏日期为：2010年04月21日的杂交瘤细胞分泌的。 

本发明所述的抗中国对虾β整合素VWA结构域单克隆抗体，能与中国对虾一种β整合素VWA结构域（β整合素蛋白N端87-349序列）发生特异性结合。 

在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增生能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗中国对虾β-integrinVWA结构域单克隆抗体。 

一种所述抗中国对虾β整合素VWA结构域克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：首先，根据引物设计原则及本实验室克隆获得的GeneBank（GU370128）中公布的中国对虾β整合素全长cDNA序列，设计含特定酶切位点的β整合素VWA结构域特异性扩增引物，以从中国对虾血细胞中抽提的总RNA经反转录合成cDNA链作为模板，经常规PCR扩增获得中国对虾β整合素VWA结构域编码基因；将目的基因双酶切后插入pET32a质粒构建表达His-β-integrin VWA融合蛋白的载体pET32a-βintegrin-VWA；PCR和测序验证无误后，转化大肠杆菌，将筛选到的阳性克隆菌放入含氨苄青霉素的培养基进行培养，诱导表达后亲和层析法纯化融合蛋白；以该纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小白鼠，采用细胞融合制备杂交瘤细胞，经过免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗中国对虾β整合素VWA结构域单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株2C5，然后采用常规方法培养上述所得到的杂交瘤细胞株2C5，收集细胞培养上清液，经纯化后得到抗中国对虾β-integrinVWA结构域单克隆抗体。