[发明专利]肠道病毒71型感染性克隆及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体地，本发明涉及肠道病毒71型感染性克隆及其构建方法和应用。

背景技术

肠道病毒71型（EV71）病毒和柯萨奇病毒A16（Coxsckie A16,CA16）是手足口病的主要病原，已在世界范围内引起多次暴发与流行，主要发病者为婴幼儿，严重危害儿童健康，CA16引起的症状轻微，而EV71的感染易引起无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病，易发生死亡。

肠道病毒71型（EV71）属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员，归属于人类肠道病毒A。根据我国卫生部的最近数据，2010和2011两个年度报道手足口病病例分别为1774669和1619706例，其中包括死亡病例905和509例。EV71抗体在成人血清中的阳性率达到65%以上，说明了这种病毒的广泛传播，每年春夏季温度升高时都会进入感染高峰期，流行趋势从散发逐渐趋于有小型聚集性爆发。

然而，手足口病的相关科研工作比较薄弱，发达国家拥有较好的科研平台，亚太地区为主要流行区域，却对EV71的关注很少，至今在临床上还没有有效的疫苗和药物，对EV71进行有效的预防和控制。

利用反向遗传学方法研究RNA病毒，在质粒水平上来操作、研究RNA病毒，获得的病毒型表型稳定，操作方便，为EV71的深入研究提供了一个很好的基础平台。但由于EV71的全长基因组有约7.5Kb的长度，因此，已报道的文章中多是通过分为多段PCR来测序或进一步构建感染性克隆，操作起来繁复较多，严重限制了对EV71的深入研究。

发明内容

基于此，本发明提供了一种肠道病毒71型感染性克隆及其简化的构建方法，以及构建得到的肠道病毒71型感染性克隆的应用。

为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种肠道病毒71型感染性克隆的构建方法，包括以下步骤：

(1)、以从肠道病毒71型毒株SZ2010-EV71提取的RNA为模板，SEQ ID NO:2为引物，反转录得到cDNA；所述SZ2010-EV71的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

(2)、以步骤(1)得到的cDNA为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，PCR扩增得到肠道病毒71型的全基因组序列；

(3)、将步骤(2)得到的肠道病毒71型的全基因组序列与载体连接，酶切，筛选得到阳性克隆，即为肠道病毒71型的感染性克隆。

在其中一个实施例中，步骤(1)中所述反转录的程序为：42℃一个小时，70℃15分钟。

在其中一个实施例中，步骤(2)中所述PCR的程序为：94℃30秒，55℃30秒，72℃8分钟，30个循环。

在其中一个实施例中，步骤(3)中所述载体为TOPO-XL-PCR载体。

本发明还提供了上述构建方法构建得到的肠道病毒71型感染性克隆。

本发明还提供了肠道病毒71型毒株SZ2010-EV71，其具有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

本发明还提供了包含上述肠道病毒71型感染性克隆的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）TOPO-SZ2010-EV71/DH5α。

本发明还提供了上述肠道病毒71型感染性克隆在制备抗肠道病毒71型药物或疫苗中的应用。

本发明从深圳市2010年手足口病的一例死亡病例的病毒分离株出发，仅用了一对引物，就扩增构建成功了感染性克隆，大大简化了EV71的反向遗传学操作步骤，为EV71重要毒株的序列获得和分析、致病机理研究、药物筛选提供方法提供了更简便的平台；在构建成功感染性克隆后，设计了八条引物对一个毒株的多个克隆进行了测序和序列比对，最终获得该毒株的全基因组序列。从而从序列到方法上都填补了国内手足口病研究的空白。为EV71的致病机理研究提供了一个有效的平台，可进行多个重要毒株或新毒株的全基因组序列获得及病毒特性分析，同时为EV71的抗病毒药物筛选平台的建立及疫苗的评估提供了重要基础。

本发明的构建肠道病毒71型感染性克隆的方法，利用一对通用引物可扩增目前临床样本的绝大多数EV71病毒。

附图说明