[发明专利]一种用枯草芽孢杆菌工程菌降解植物的木质素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建和应用微生物工程菌的方法。具体是应用微生物工程菌降解植物原料的木质素的方法。 

背景技术

锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase，MnP)、木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase，LiP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木质素的作用。 

植物资源不断再生，十分丰富。植物的基本成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中在制造沼气和乙醇业中有用的成分是纤维素，次之是半纤维素。前者由葡萄糖构成，而后者由戊糖构成。这些糖都是转化为乙醇和沼气的物质。但是纤维素分子之间被木质素镶嵌，被镶嵌着的纤维素不能被水解。木质素是广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物，形成纤维支架，结构十分稳定。欲利用纤维素则必须先降解木质素。当前用于降解木质素的方法有物理、化学和生物的方法。物理法主要是机械粉碎法、高温热解预处理以及辐射预处理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊设备；化学法主要是酸或碱处理的方法。化学处理法具有工艺简单的特点，但是处理后的纤维素和半纤维素损失大，并且产生大量的酸碱废气物污染环境。与化学法和物理法相比，当前应用的生物法主要是应用天然的表达分泌降解木质素的酶的白腐真菌与植物原料作用而降解植物原料中的木质素。应用白腐真菌降解植物的木质素的优势在于，白腐真菌具有完整的降解木质素的酶系(锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶)，其不足之处是白腐真菌所含的锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因只是单拷贝，表达的酶的产量少，并且，白腐真菌生长缓慢，降解木质素的周期长。 

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是常用于生产重组蛋白的微生物。枯草芽孢杆菌营养要求低，生长能力强，能将表达的蛋白分泌到胞外。 

发明内容

本发明通过分子生物学技术构建含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌；用含木质素过氧化物酶基因表达框架、锰过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌与植物原料作用，通过含木质素过氧化物酶基因表达框架、锰过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶而降解植物原料的木质素。 

本发明所采用的技术方案是： 

1.克隆基因：应用反转录PCR或PCR从含锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因、漆酶基因的微生物中分别克隆锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶基因。 

2.通过PCR扩增或DNA序列合成而获得构建表达载体所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子和抗性基因表达框架的DNA序列。 

3.通过分子生物学技术构建含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体(附图1)。 

4.将以上构建的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌。根据表达载体上的G418抗性筛 选高拷贝重组子作为含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌。 

5.将以上构建含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌应用于降解植物的木质素。 

本发明构建了含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌，将这种枯草芽孢杆菌工程菌与植物原料作用，降解植物的木质素的优点体现于： 

由于工程菌的构建选择了强的启动子调控基因，选择生产性能好的微生物作为工程菌构建的对象，并且选择高拷贝的重组子作为工程菌，所以，本发明构建的含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和含漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌不仅具备枯草芽孢杆菌本身的营养要求低、生长繁殖迅速等特点，还具备工程菌的良好表达分泌降解木质素的酶系(锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶)的功能，这种含锰过氧化物酶基因表达框架、木质素过氧化物酶基因表达框架和漆酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌工程菌的木质素的降解作用强于当前应用于降解植物的木质素的天然的表达分泌木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的天然的微生物。 

附图说明

附图1.枯草芽孢杆菌表达载体。