[发明专利]在仓鼠细胞中的重复位点处进行定点重组的组合物和方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及可用于在仓鼠细胞基因组的重复位点处进行基因重组的组合物和方法，以及由此产生的重组细胞。

背景技术

诞生于上个世纪70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。

在基因工程研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞，我国批准上市的有促红细胞生成素（EPO）、CHO基因工程乙肝疫苗、治疗性抗体药物益赛普（有效成分相当于美国食品药品管理局批准的Enbrel）和泰欣生（有效成分相当于美国食品药品管理局批准的Erbitux）等生物技术药物。

与其他表达系统相比，CHO细胞具有许多优点，例如：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。

但是，目前在CHO细胞表达系统的构建和应用中仍存在诸多问题有待解决，例如：①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低；②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高效表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少；④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。

目前在CHO细胞中进行的外源基因表达主要有两种形式，一种是瞬时表达，另一种是稳定表达。前者完全由导入的质粒来执行，质粒不会插入到细胞的基因组中，虽然不会引发DNA重排和受到调控序列的影响，但是绝大多数转入的外源基因会被降解或随细胞分裂丢失。相反，后者被导入的外源基因整合到细胞基因组中，通过一些筛选方法，最终可以得到富集外源基因整合的细胞系，但是现有技术无法实现定点整合或者在优选的靶位点处进行整合。外源基因随机整合引发DNA重排、受体细胞裂解死亡的概率很高，而当整合入或靠近异染色质区域时，外源基因的表达将被阻遏。

因此，本领域仍需开发出更成熟的CHO细胞表达系统，以提供对整合位点的控制，并提高表达效率和可操控性。

发明内容

本申请提供了能够在靶核苷酸序列中定点重组外源序列的组合物和方法。

在一方面，本申请提供了分离的多核苷酸，其含有重复位点的至少7个连续核苷酸，其中所述重复位点存在于仓鼠细胞的染色体或基因组中。在某些实施方式中，所述重复位点选自SEQ ID NOs:3、16、39、40、和41所示的序列。在某些实施方式中，所述重复位点含有重复序列单元。在某些实施方式中，所述仓鼠细胞的染色体或基因组中含有所述重复序列单元的至少两个拷贝。在某些实施方式中，所述重复序列单元选自如SEQ ID NOs:42-46所示的序列。

在另一方面，本申请提供了低聚化合物，含有可特异性杂交于靶位点的靶区域，所述靶位点含有重复位点或重复序列单元的至少7个连续核苷酸，其中所述重复位点或重复序列单元存在于仓鼠细胞的染色体或基因组中。在某些实施方式中，所述靶区域含有低聚的核苷酸。所述靶区域可以含有至少一个修饰的核苷酸。至少一个所述修饰的核苷酸可以是锁核酸。

在某些实施方式中，所述靶区域是5’→3’走向的，且所述靶位点是3’→5’走向的，或者所述靶区域是3’→5’走向的，且所述靶位点是5’→3’走向的。在某些实施方式中，所述靶区域与所述靶位点有50%到100%的互补性。