[发明专利]富硒大米中有机硒、蛋白硒、多糖硒或RNA硒含量测定方法

权利要求书

1.富硒大米中有机硒、蛋白硒、多糖硒或RNA硒含量测定方法，其特征在于，所述测定方法包括下列步骤：

（1）样品的制备：将待检测的富硒大米粉碎获得粒度为100目的富硒大米干粉，密封储存备用；

①有机硒的提取：称取上述富硒大米干粉1.00g，加入5~10ml超纯水，进一步研磨使富硒大米干粉充分破裂，定量转移至透析袋中，用超纯水透析24h，将透析后的样品取出，于12000rpm条件下离心15min获得沉淀，所述沉淀真空干燥得有机硒m₁g；      

②蛋白硒的提取：称取上述富硒大米干粉10.00g，于500ml三角瓶中，加入0.05mol/LNaOH溶液100ml振荡2h得混合液，将混合液于12000rpm条件下离心15min，取上清液，加入0.1mol/LHCl调节pH至5.5，再次于12000rpm条件下离心15min得沉淀，将所述沉淀真空干燥得蛋白硒m₂g；

③多糖硒的提取：称取上述富硒大米干粉2.00g，加入100ml 0.5mol/LNaOH溶液，于80℃水浴加热2h提取多糖，然后于12000rpm条件下离心15min，取上清液用氯仿-正丁醇溶液洗涤3次，所述氯仿与正丁醇的体积比为24:1，然后加入无水乙醇至溶液最终乙醇浓度为80%，静置24h，收集沉淀，将所述沉淀真空干燥得多糖硒m₃g；

④RNA硒的提取：称取上述富硒大米干粉10.00g，加入200ml 0.025mol/LNaOH溶液摇振荡45min，然后用3mol/L盐酸调pH至7.0，搅拌10min后加热至90℃，保温10min后冷却至10℃，于12000rpm离心15min，取上清液用6mol/L盐酸调pH至2.5，5℃冷藏静置过夜，再次于12000rpm离心15min，收集沉淀加入1~2滴氨水，用30ml蒸馏水溶解，用氯仿-正丁醇溶液洗涤3次，所述氯仿与正丁醇的体积比为24:1，将得到的水相烘干获得RNA硒m₄g；

（2）硒含量的测定

①标准曲线：按0、4、8、12、16、20 μg/L的浓度梯度绘制标准曲线；

②消化液制备：分别称取上述提取获得的有机硒、蛋白硒、多糖硒和RNA硒0.3g于50ml三角瓶中，加10ml由HNO3和HClO4按体积比4：1混合制得混合酸，冷消化过夜，次日加热消化，当溶液变为清亮无色并伴有白烟出现时，再继续加热至剩余体积2ml左右，冷却，再加5ml 6mol/L盐酸，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，冷却，转移定容至50ml，获得消化液；

③测定：分别取上述消化液各2ml于10ml比色管中，加入浓盐酸2ml，加水定容至10ml，混匀后采用氢化物原子荧光法测定，依次获得峰面积荧光值X₁ 、X₂ 、X_3、 X₄，将峰面积荧光值X₁ 、X₂ 、X_3、 X₄分别带入标准曲线获得有机硒、蛋白硒、多糖硒和RNA硒消化液硒浓度为Y₁、Y₂、Y₃、Y₄；

（3）数据处理

①富硒大米中有机硒含量= Y₁*0.25÷0.3* m₁÷富硒大米质量，其中富硒大米质量为1.00g；

②富硒大米中蛋白硒含量= Y₂*0.25÷0.3* m₂÷富硒大米质量，其中富硒大米质量为10.00g；

③富硒大米中多糖硒含量= Y₃*0.25÷0.3* m₃÷富硒大米质量，其中富硒大米质量为2.00g；

④富硒大米中RNA硒含量= Y₄*0.25÷0.3* m₄÷富硒大米质量，其中富硒大米质量为10.00g。

2.根据权利要求1所述的富硒大米中有机硒、蛋白硒、多糖硒或RNA硒含量测定方法，其特征在于：有机硒提取采用的透析袋规格为8000Da，透析过程中每6h离心更换一次超纯水。