[发明专利]等位基因变体检测方法、试剂盒及组合物

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，更具体地说，涉及到一种利用等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR）检测等位基因变体的方法试剂盒及组合物。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)是人类基因组中最常见的遗传多样性的类型，其在人类基因组DNA中的发生频率为：1,000个核苷酸中有大约1个SNP，或更低。SNP牵涉于遗传病症、对不同疾病的易感性、对药物的不良反应的倾向性，以及用于法医研究。因此，SNP(或稀少突变)的检测为疾病早期诊断，例如检测血液中的循环癌细胞以进行出生前的诊断，以及用于检测混合的细胞群体中的疾病相关突变提供了巨大的潜在可能，而利用SNP鉴定与疾病或药物反应有关的靶基因是当前相关研究的焦点。

基于涉及杂交、连接或DNA聚合酶的方法开发了多种用于SNP基因分型的方法。例如，等位基因特异性聚合酶链式反应(AS-PCR)被广泛应用于检测DNA序列变异，然而，AS-PCR利用了DNA聚合酶的保真度：相对于以匹配的3'碱基进行的引物延伸，以错配的3'碱基进行的引物延伸的效率要低得多，后者的效率为前者的1/100至1/100,000。然而，AS-PCR的特异性和选择性高度依赖于PCR的指数扩增性质，这使得PCR区分等位基因的能力随着扩增循环的增加而迅速降低。虽然引物可设计为匹配特异性变体以选择性地仅扩增该变体，但是在实际中，错配的引物经常仍然能够发生显著的扩增。此外，AS-PCR区分等位基因变体的能力会受到突变类型或者突变或SNP周围的序列的影响、存在于样品中的等位基因变体的量的影响、以及与备择等位基因之间的比例的影响。综合起来，这些因素常导致经常出现假阳性结果，使AS-PCR的可信度有待替提升。

用于区分等位基因变体的另一种涉及探针杂交方法的技术是基因分型。然而，与AS-PCR一样，使用该方法的选择性受到局限，并且不适合于检测混合样品中的稀少(≥1,000个中的1个)等位基因或突变。

发明内容

本发明的目的是针对现有的探针杂交方法例如AS-PCR或基因分型在等位基因的变体检测上检测率低的问题，提供一种等位基因变体检测方法、试剂盒及组合物。

本发明就上述技术问题提供的技术方案如下：

本发明提供一种等位基因变体检测方法，包括以下步骤：

向核酸样品中加入突变型等位基因的特异性引物及其反向引物以及在杂交过程中3'端不能被聚合酶延伸的阻滞子，并加入荧光染料或检测指针，所述核酸样品中包含靶序列的突变型寡核苷酸及靶序列的野生型寡核苷酸，所述突变型寡核苷酸包含所述突变型等位基因，所述阻滞子与所述野生型寡核苷酸序列互补，所述野生型寡核苷酸包含野生型等位基因，所述突变型等位基因与所述野生型等位基因具有相同的基因座；

所述靶序列的野生型寡核苷酸与所述阻滞子杂交，所述突变型寡核苷酸与所述突变型等位基因特异性引物及所述反向引物杂交并产生突变型扩增子；

利用所述荧光染料或所述检测指针对所述突变型等位基因进行实时特异检测。

本发明的等位基因变体检测方法中，所述特异检测包括：

检测所述荧光染料的荧光变化或检测所述检测探针的可检测性质的变化来检测所述靶序列上的突变。

本发明的等位基因变体检测方法中，所述突变型等位基因与所述野生型等位基因具有相同的基因座。

本发明的等位基因变体检测方法中，对应于所述特异性引物的3'端的所述突变型寡核苷酸的至少一个核苷酸不同于所述野生型寡核苷酸的对应位置的核苷酸。

本发明的等位基因变体检测方法中，所述阻滞子为吗啉基或异核酸。

本发明的等位基因变体检测方法中，所述阻滞子与所述靶序列的突变型寡核苷酸之间的解离温度Tm低于所述突变型等位基因特异性引物与所述靶序列的突变型寡核苷酸之间的解离温度Tm。

本发明的等位基因变体检测方法中，所述检测探针为基因座特异性检测探针。

本发明的等位基因变体检测方法中，所述检测探针为5‘核酸酶探针。

本发明的等位基因变体检测方法中，所述核酸样品中还包括所述聚合酶，脱氧核糖核苷三磷酸dNTP和/或适合于实时聚合酶链式反应PCR扩增的缓冲剂。

本发明的等位基因变体检测方法中，所述聚合酶为Taq DNA聚合酶。

本发明的等位基因变体检测方法中，所述检测探针为TaqMan探针。

本发明的等位基因变体检测方法中，所述核酸样品为包含肿瘤细胞的血液样品。