[发明专利]用于检测蓝氏贾第虫人畜共患基因型的HRM引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于贾第虫病诊断和检测技术领域，特别涉及一种用于检测蓝氏贾第虫人畜共患基因型的HRM引物及其应用。

背景技术

贾第虫是一类肠道鞭毛虫，宿主范围广泛，可感染包括人在内的多种脊椎动物。根据形态学差异、超微结构和宿主来源不同可将贾第虫分为6种：敏捷贾第虫（Giardia agilis）、苍鹭贾第虫（Giardia ardeae）、鹦鹉贾第虫（Giardia psittaci）、微小贾第虫（Giardia microti）、鼠贾第虫（Giardia muris）和蓝氏贾第虫（Giardia lamblia）。其中蓝氏贾第虫是唯一可感染人类的贾第虫，其滋养体寄生在人的小肠，可引起以腹泻为主的贾第虫病。该病的世界范围感染率约为30％，我国感染率各地区不等，约为1～20％。目前，贾第虫病已被列为全世界危害人类健康的10种主要寄生虫病之一。

目前，蓝氏贾第虫已区分为7个主要的集聚体或基因型A-G。A型和B型具有较广泛的宿主范围，可感染包括人在内的多种哺乳动物，如犬猫、家畜和野生动物，称之为人畜共患基因型。其它基因型称之为宿主特异性基因型，C型和D型可感染犬，E型可感染偶蹄类哺乳动物，F型和G型可分别感染猫和家鼠。

蓝氏贾第虫的检测方法主要有病原学、免疫学和分子生物学检测。显微镜检查简单易行，但特异性和敏感性不强；免疫学检测敏感性较高，但对抗原的要求较高，且很难区分既往感染和现症感染；常规PCR技术能够快速、特异地检测目的基因，但是不能定量、需要接触EB等有害物质、易污染、易出现假阳性。而且从技术上讲，常规PCR不能区分仅相差几倍拷贝数的起始模板量。荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法以其快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、可实时监测及自动化程度高等优点成为核酸检测的重要工具。在荧光定量PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行实时监测和连续分析荧光信号，随着反应时间的延续，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并由此推断模板最初的含量。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝数，荧光定量PCR采用参数值，所谓C代表循环（cycle），T代表域值（threshold）。CT值是指每个反应管内的荧光CT信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究结果表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，只要获得未知样品的值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

高分辨率熔解法（HRM，high-resolution melt）是最新开发的低成本和操作简单的高通量突变扫描和基因分型技术。该技术在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，通过饱和染料监控核酸的熔解过程，得到特征性熔解曲线，再根据熔解曲线的变化来判断核酸性质的差异。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，并且实现了真正的闭管操作。实验证明，熔解曲线的变化取决于扩增子的序列、长度和GC含量，因此，可以通过熔解曲线的变化反映核酸性质的差异。现今熔解曲线研究使用最多的是用SYBR Green I染料在定量PCR仪上监控熔解曲线的变化。该染料是双链DNA最常用的荧光标记物，但它是不饱和染料，不能保证全部PCR产物都能嵌合上。在DNA双链解链的过程中，SYBR Green I分子会发生重排，从已解链DNA片段上脱离下来的染料分子又与尚未解链的双链DNA结合，造成结果失真，并且嵌合到产物中的染料如果在扩增过程中不能及时脱落，还会抑制PCR反应。迄今尚无一种HRM PCR方法对贾第虫基因型的混合感染进行检测。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于检测蓝氏贾第虫人畜共患基因型的HRM引物。

本发明的另一目的在于提供所述的用于检测蓝氏贾第虫人畜共患基因型的HRM引物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于检测蓝氏贾第虫人畜共患基因型的HRM引物，其核苷酸序列如下所示：

TPI1：5'-CTTCATCGGYGGTAACTT-3'，

TPI3：5'-GGCACGCTTMGCCTTCTT-3'；

TPI1：5'-CTTCATCGGYGGTAACTT-3'，