[发明专利]低温脂肪酶Lip1及其基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶基因工程和酶工程领域，具体涉及一种低温脂肪酶Lip1及其基因与应用。

背景技术

脂肪酶（Lipase，EC 3.1.1.3）是一类在油-水界面上催化天然油脂（甘油三脂）降解为甘油和游离脂肪酸的酶，广泛存在于植物、动物和微生物中。因为其具有不需要辅酶就能催化正逆反应的优点，近些年来，脂肪酶作为类脂化合物合成分解和酯交换的催化剂，已广泛应用于油脂水解、食品风味和香味的改进、皮革绢纺脱脂、生物柴油制备及添加于洗涤剂中以提高去污能力等。

目前工业上应用的脂肪酶大多是中温和高温脂肪酶，它们大多由微生物产生，且基本上为胞外酶，产酶的最适温度多在30℃以上，而酶的最适反应温度一般在40℃左右或更高，在0℃附近普遍丧失活性。目前研究的低温脂肪酶普遍由低温微生物分泌产生，酶的最适反应温度一般均低于40℃，而在0℃仍具高酶活。由于它们普遍具有低温下酶活力高、抗有机溶剂等特点，因而成为了近年来酶学研究及工业应用探索的一个热点。

生物柴油是由动植物油脂与一些短链醇发生转酯反应生成的脂肪酸酯类物质，是一种新型的无污染的可再生能源。生物柴油的生产方法有化学法和生物法，化学法使用的催化剂多为酸碱催化剂，容易造成二次污染；而生物法利用酶作为催化剂，具有反应条件温和、对环境友好、反应过程简单易控等优点；因此酶法生产生物柴油的研究己受到广泛关注。由于酶法合成生物柴油一般是在有机溶剂中进行，考虑到反应底物和产物的易挥发性，在低温条件下更加有利于酶反应的进行，并且也可同时改善生物柴油的特性（Juan 等，EP1331260，2003 ）。

在洗涤行业，我国的洗涤方法是以低温洗涤为主，近来为了节省能源，欧美国家也出现了洗涤温度低温化的趋势，中温脂肪酶由于在低温条件下酶活差，效率低，达不到最佳应用效果，只有增加用量才能达到最佳应用效果。因此理想的洗涤剂用脂肪酶是在低温下也能充分发挥作用的脂肪酶。

低温脂肪酶的最适酶活温度一般在40℃以下，它具有最适酶活温度低，在低温下具有更高的催化效率等特点。因而在洗涤剂、生物柴油制备等工业上应用有着中温脂肪酶无法取代的优越性。

脂肪酶己从多种不同的微生物中分离，已有一些来自细菌的低温脂肪酶，如嗜冷菌Psychrobacter immobilis 产生的脂肪酶，最适温度为55℃；假单胞菌Pseudomonas sp. B11产生的脂肪酶最适温度为为45℃；但目前还未见最适温度低于30℃低温脂肪酶的报道。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种新型低温脂肪酶Lip1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明中低温脂肪酶是具有SEQ ID NO：2氨基酸残基序列的蛋白质，或与SEQ ID NO：2 的氨基酸残基序列具有至少80％的同源性且具有与SEQ ID NO：2蛋白质相同活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质，由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质是将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2蛋白相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

本发明另一目的是提供一种编码上述低温脂肪酶Lip1的基因。

本发明中所述低温脂肪酶Lip1的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有80％以上同源性的核苷酸序列，且该序列编码相同功能蛋白质的DNA 序列，或编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列蛋白质的多核苷酸。

本发明另一目的是提供含有低温脂肪酶Lip1基因的重组表达载体pET28a-lip1，将表达载体pET28a-lip1导入大肠杆菌细胞内，通过诱导剂IPTG的诱导，完成低温脂肪酶Lip1的表达，从而为利用该表达载体制备低温脂肪酶Lip1和其工业生产奠定理论基础。

本发明另一目的是将低温脂肪酶Lip1应用在中长链的脂肪酸酯催化中，本发明采用橄榄油作为底物验证脂肪酶的催化活性。

为了实现本发明的上述目的，本发现提供了下述技术方案：

1、低温脂肪酶Lip1基因的获得

（1）以耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）KM1（本实验室分离自昆明市肉联厂冷库，菌株已经于2008年8月26日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，保藏号为：CGMCC No.2637）的基因组DNA为模板利用以下引物进行PCR扩增，引物序列如下：