[发明专利]转基因抗虫水稻的培育方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用农杆菌介导的遗传转化技术将外源基因导入水稻受体品种从而获得转基因抗虫水稻的方法。 

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤、尘埃、水域、沙漠、植物、昆虫尸体中(贾士荣等，2001)。1901年，日本学者石渡从染病的家蚕体液中首次分离出Bt菌，并证明部分Bt对鳞翅目昆虫有杀虫活性。二十世纪50年代，人们发现Bt菌的杀虫活性与伴胞晶体有关(Hannay1953)，并证实这种伴胞晶体由蛋白质组成(Hannay和Fitz-James1955)。这种蛋白被称作δ内毒素(δ-endotoxins)或杀虫晶体蛋白(insecti cidal crystal protein，ICP)。杀虫晶体蛋白的分子量一般为130-140KD左右，其基因一般位于苏云金芽胞杆菌的质粒上。目前人们已从不同的Bt菌的亚种中分离出对不同昆虫(如鳞翅目、鞘翅目、双翅目、螨类等)和无脊椎动物(如寄生线虫、原生动物等)有特异毒杀作用的杀虫晶体蛋白。 

Bt杀虫晶体蛋白本身不具有生物活性，称为原毒素(protoxin)。当昆虫吞食Cry晶体原毒素后，肠道中的碱性环境和大量的蛋白酶会将晶体蛋白水解成毒性肽。活化的毒性肽的细胞结合区与肠道上皮细胞纹缘受体(BBMV)结合，而毒性区作用于细胞膜，改变肠道细胞膜离子的通透性，产生小孔，破坏渗透平衡，使细胞裂解，最终使昆虫厌食而亡。 

Bt杀虫晶体蛋白一般为碱溶性，即需要在碱性条件下才能溶解，毒蛋白才能活化。由于不同昆虫的消化道的pH环境不一样，所以它直接影响Bt杀虫蛋白的杀虫活性。以Cry1蛋白为例，其作用的鳞翅目昆虫的消化道pH值为pH10-11，在这种碱性条件下，Cry1原毒素的分子间二硫键被破坏，成为分子量为130-140kDa的原毒素(Bietlot et al.，1990；Du et al.，1994)。接着在昆虫消化道的一些蛋白酶的作用下，逐步除去C端的约60kDa和N端的3-5kDa的结构片段，从而成为62-65kDa不被蛋白酶降解的活性毒素(Rajamohan et al.，1998；Schnepf et al.，1998；Frutos et al.，1999)。故原毒素能否激活是产生毒性的首要条件。 

1981年，Schnepf和Whiteley首次将Bt库斯塔克亚种(subsp.Kurstaki)菌株HD-1中的杀虫晶体蛋白基因克隆到了大肠杆菌质粒中。随后，有学者将Bt基因转入烟草(Adang et al.，1987；Barton et al.，1987；Vaeck et al.，1987)、西红柿(Fischhoff et al.，1987)、棉花(Perlak et al.1990)等获得了相应的抗虫转Bt基因植物。 

虫害是水稻(Oryza sativa L.)生产的大敌，造成水稻减产、品质下降。其中，危害水稻最主要的害虫是鳞翅目的二化螟(Chilo suppressalis)、三化螟(Tryporyza incertulas)和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)。二化螟和三化螟主要危害水稻茎秆，在苗期和分蘖期造成枯心；在孕穗初期侵入，造成枯孕穗；在孕穗末期和抽穗初期侵入，造成白穗(Pathak，1977)。稻纵卷叶螟[Cnaphalocrocis medinalis(walker)]则以幼虫缀丝纵卷水稻叶片成虫苞，幼虫匿居其中取食叶肉，形成白色条斑。长期以来，螟虫主要通过化学农药进行防治，不但增加了水稻生产成本，而且造成了环境污染、农药残留等问题(Pingali and Roger1995)。 

水稻是东南亚人民的主食作物，故发展转Bt水稻对于亚洲国家具有特殊意义。第一，水稻的种植面 积大，全球每年种植水稻面积超过了1.45亿公顷，而亚洲的种植面积占总种植面积的90％以上，故发展转Bt水稻利益巨大。第二，水稻的主要害虫，如二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等均为鳞翅目昆虫，在Bt蛋白的有效毒杀范围内。第三，通过大规模的筛选，目前尚未在水稻中找到有效控制虫害的抗性基因资源。因此，通过转基因培育抗虫水稻是解决上述问题的最有效途径。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种培育转基因抗虫水稻的方法，其中基因转化的受体为水稻品种明恢63，所使用的目的基因为杀虫基因cry1C(其核苷酸序列见中国发明专利ZL02139081.9文献和本说明书的序列表SEQ ID NO：1)。