[发明专利]一种合成γ-聚谷氨酸的谷氨酰转肽酶及其编码基因

权利要求书

1.一种谷氨酰转肽酶蛋白质分子，其特征在于，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.一种分离出的谷氨酰转肽酶基因，其特征在于，该谷氨酰转肽酶基因具有编码权利要求1中蛋白质分子的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的谷氨酰转肽酶基因，其特征在于，该谷氨酰转肽酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4.如权利要求2所述的谷氨酰转肽酶基因，其特征在于，该序列无内含子，具有1782bp完整的开放读码框，编码593个氨基酸的多肽。

5.一种获取谷氨酰转肽酶基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一、提取沿海红树林淤泥样品，提取起总DNA并纯化；

步骤二、将纯化后的总基因组经Sau3AI酶切处理；

步骤三、将酶切产物连接到pUC18/BamHI(BAP)载体上，电击转化大肠杆菌JM109中构建红树林宏基因组文库，用含有l-氨苄青霉素、γ-谷酰基-对硝基苯胺、葡萄糖和氨基酸复合物的培养基作为选择培养基，从文库中筛选谷氨酰转肽酶阳性克隆，通过高通量筛选得到阳性克隆子；

步骤四、经测序和Blast比较设计引物，以阳性克隆子的质粒为模板，用设计好的引物进行链式酶聚合反应，从而克隆得到如SEQ ID NO:1所示的目的片段。

6.如权利要求5所述的谷氨酰转肽酶基因，其特征在于，步骤四中设计用于扩展目的片段的引物包括：

上游引物F1：5’-CGCGGATCCATGGCTTTCACCCTGTGGGT-3’；

下游引物F2：5’-CGGAAGCTTCTGGTAACCTTCCAGAGC-3’。

7.一种重组谷氨酰转肽酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）采用如权利要求5中所述方法获取谷氨酰转肽酶基因，该基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

（2）用上述基因目的片段经过HindIII和BamHI双酶切，与表达载体pET-32a(+)连接；

（3）用表达载体pET-32a(+)转化宿主细胞BL21，培养转化体，经IPTG诱导，从培养物分离、纯化，获得重组谷氨酰转肽酶。

8.一种利用重组谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）采用如权利要求5中方法制备重组谷氨酰转肽酶；

（2）将上述重组谷氨酰转肽酶粗酶液或纯化的酶液加入到谷氨酰胺溶液中，以 Tris-HCl缓冲液调节PH为7.0-8.0，在15-30℃条件下进行酶催化反应6-12h，合成γ-聚谷氨酸，并加入终止液终止γ-聚谷氨酸反应。

9.如权利要求8所述利用重组谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，合成的γ-聚谷氨酸的分子量大小为5~10kDa。

10.如权利要求8所述利用重组谷氨酰转肽酶合成γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤（2）中酶催化反应的最适温度为20℃，最适pH值为7.0，最适底物浓度为10M谷氨酰胺。