[发明专利]一种登革病毒简并疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种登革病毒简并疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

登革病毒(dengue virus,DV)是黄病毒属(Flaviviridae)有包膜的单股正链RNA病毒，以蚊虫为媒介，广泛流行于热带和亚热带地区。DV感染所致的人类登革热(classical dengue fever,DF)和登革出血热/登革休克综合征(dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS)严重危害人类健康。全球有25～30亿人生活在流行区内，每年有1亿以上的人遭受感染，DHF病例约50万,死亡率5～20％，如治疗不及时可达50％。近年来，随着全球气候变暖、人口流动、生态环境恶化、蚊媒分布区域扩展等诸多原因，登革热流行的范围和频率不断增加，WHO已将DHF/DSS、肝炎、疟疾、结核列为全球流行最严重的传染病（Murgue B.2010）。我国海南、广东、广西、福建、浙江和台湾等地区也都是重点流行区域，多次发生DF，DHF/DSS的爆发流行。但时至今日，对DV感染性疾病尚无特异的治疗手段，也无安全有效的疫苗问世(Mathew A.et al.2008)。自然界存在的登革病毒有四种血清型（DV-1-4），感染其中的任何一型均可产生对此种血清型病毒的终身免疫，但不同型之间的交叉保护性免疫较为短暂，并且病毒感染产生的非中和抗体还可介导抗体依赖的感染增强现象(Antibody-dependent enhancement,ADE)，导致严重的DHF和DSS的发生（Morens DM,et al.1987）。因此，对1-4型DV的有效免疫分子展开深入研究，并从中发掘有效的治疗策略和途径，研制出可同时针对四种血清型病毒的疫苗是当前登革热控制的当务之急。

要认识DV的有效免疫分子，首先得从DV的结构入手。DV基因组（约11kb）可编码3种结构蛋白（衣壳蛋白C,基质蛋白M和包膜糖蛋白E）和7种非结构蛋白（NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5）(Leyssen P,et al.2000)。其中，糖蛋白E位于DV包膜上，是DV吸附靶细胞的重要功能蛋白(Modis Y,et al.2004)，由三个功能区构成：中心区（Domain I），二聚体形成区（Domain II）和一个受体结合区（Domain III）。DV E蛋白DⅢ区是决定病毒与受体结合的关键结构域，由E蛋白的295～392位残基构成，没有糖基化位点，但有一对二硫键（Cys302-Cys333）对维持其结构很重要，残基382-386形成一个受体结合Loop环，是DV识别和结合靶细胞上病毒受体的重要功能位点，决定着DV感染的靶细胞种类和组织嗜性(Matsui K,et al.2009)。虽然DV的受体尚未确定，但利用纯化的DV E蛋白DⅢ区（EDIII）及其抗血清可在体外阻断DV的感染(Batra G,et al.2010)，证实了E DⅢ区是DV识别靶细胞上病毒受体的功能域,且有保护功能。

古巴PCT/CU2006/000015公开了Ｅ蛋白的表面的保守区域用于预防和／或治疗由登革病毒1-4和其他黄病毒引起的感染，涉及嵌合蛋白质，其用作疫苗或用于针对登革病毒的4种血清型和其他黄病毒的预防性或治疗性治疗。但因血清型别的差异，交叉保护作用弱。

古巴PCT/CU1998/000001公开了登革病毒的前M/M蛋白的表位、合成肽，涉及5种登革2型病毒前M/M蛋白的合成肽，能激发抗四种登革病毒血清型的中和抗体。但登革病毒的preM/M蛋白有很强的非中和表位（Dejnirattisai M,et al.Science,2010）,由此引发的抗体依赖的感染增强现象（ADE）不容忽视。

印度Etemad B等（2008）和我国学者Chen S等（2007）将4种血清型登革病毒E蛋白的特定区域融合在一起，构建成4价重组蛋白疫苗，在动物水平有一定保护作用，中和滴度为1:47-1:588，对各型DV的保护力差异较大，不利于推广。

美国Bowen等（2012）公开了一种用计算机根据671株DV EDIII蛋白序列设计的物理、化学一致性EDIII蛋白结合抗体的方法，产生的抗体虽然保护范围广，但特异性较差，可能对特异流行株感染的保护效果不佳，不利于推广。

法国Sabchareon等（2012）报道的首个登革热疫苗—CYD-TDV重组减毒四价登革病毒疫苗能够对1,3和4型登革热病毒株具有免疫作用，但其整体效果并不理想，它对于在泰国最常见的2型登革热病毒株起不了任何防护作用。