[发明专利]红掌MYB转录因子AN2-like的克隆及表达载体构建

说明书

技术领域

本发明涉及红掌中MYB转录因子基因anthocyanin2-like（AN2-like）的克隆、重组及对花青素合成调控功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

MYB是植物转录因子中最大的家族之一，大多数植物的MYB以在其Ｎ端含有一段约51-52个氨基组成的MYB结构域为共同特征。MYB蛋白的分类主要是根据这个高度保守的DNA结合结构域这个结构域通常是由至多4个氨基酸残基序列的重复（R）组成每一个都形成3个α-螺旋每一个重复的第二个和第三个螺旋形成一个带有3个有规律的间隔色氨酸残基（或疏水）的螺旋-转角-螺旋（HTH）结构，形成一个3D HTH疏水核心结构，对维持HTH的构型有极为重要的意义。MYB在拟南芥中已经有很多报道，主要集中于次生代谢调节、抗逆性的研究等，具有广泛的转录调节作用，大多数MYB转录因子是基因表达的正调控因子，但是也有一部分是负调控因子。花青素相关的MYB转录因子通常包含R2和R3两个基序(R2R3-MYB)或包含1个R3基序(R3-MYB)，含有特异的DNA序列识别区和启动子结合区。许多现象表明一些MYB转录因子有双重功能，即：作为结构基因的直接活化子和作为活化bHLH基因的活化子。迄今为止，研究发现花青素结构基因调控的一般都是由MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白形成一个蛋白复合体，直接调控结构基因的转录，而不合成中间调控物。

红掌中AN2-like转录因子与其它作物MYB转录因子高度同源，氨基酸序列分析发现其具有两个典型的SANT结构域，其为“SWI3、ADA2、N-CoR和TFIIIB”的DNA结合域，一般为两个串联存在并通常结合于DNA端粒的序列重复部位，形成加帽结构。其结合依赖于DNA序列上重复的G/C富集识别序列[C2-3A(CA)1-6]。这种结构通常存在于转录调控抑制因子复合体的结合DNA部位。本实验中的AN2-like转录因子有可能为具有花青素合成负调控作用的MYB转录因子。

红掌花青素缺失的突变体中，植株表现为白色佛焰苞和绿色叶柄和幼叶，正常野生型应为红色佛焰苞和淡红色叶柄和幼叶。生物信息学分析和分子生物学实验显示其表达分析在突变体中显著高于野生型。转基因拟南芥植株表现为植株纯绿色（尤其在幼苗期），而正常野生型拟南芥茎杆和部分叶片通常带有红色。

在本实验中，相较于野生型，红掌突变体中AN2-like特异性表达升高，造成转基因拟南芥植株花青素缺失现象。

发明内容

本发明首次从红掌中分离出AN2-like基因的全长cDNA。

一、红掌AN2基因的克隆

以红掌“阿拉巴马”为材料，利用CTAB法提取总RNA，反转录合成cDNA，设计全长cDNA扩增引物：

5’端引物:5’TCACAAATTAGCACAGAGGTG3’

3’端引物:5’GAGAGGAGTGTCTACGATGGT3’

PCR体系及条件为：