[发明专利]一种新普鲁兰酶的制备和分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵产生新普鲁兰酶及这种酶的分离提取方法。

 

背景技术

新普鲁兰酶(neopullulanase，nPU，EC3.2.1.135) 属于葡萄糖苷水解酶类(Glycosyl hydrolase family)的α-淀粉水解酶族13(α-amylase family 13)中的一种，它是一个多功能复合型的淀粉水解酶，能催化淀粉四种的反应：水解α-(1→4)糖苷键、水解α-(1→6)糖苷键、α-(1→4)键的转糖苷作用、α-(1→6)键的转糖苷作用。因此，新普鲁兰酶具有普鲁兰酶（pullulanase，PU，EC3.2.1.41）的活性，可将普鲁兰的α-(1→6)糖苷键断开，生成麦芽三糖；又具有α-淀粉酶（EC3.2.1.1）的活性，可将普鲁兰水解生成潘糖；另外，在高糖浓度下，新普鲁兰酶还具有转α-(1→4)和α-(1→6)糖苷作用，可将葡萄糖苷的分枝连接方式在α-(1→4)和α-(1→6)中相互转换。

在自然界，每种植物都能利用光合作用合成淀粉并将之贮存起来，为人类和动物提供源源不断的能量。作为最原始的贮存能源，淀粉是很重要的多糖，在食品、饮料工业中是必不可少的原料，可作为食品加工原料或添加剂用于粉丝、凉粉、雪糕、方便面、饮料等产品中。随着科学技术的发展，以淀粉为原料经物理、化学方法及酶制剂的处理，可改变原淀粉的溶解度、黏度、渗透性、凝胶性、吸水性等理化性能，生产出一系列不同性能的变性淀粉、淀粉衍生物、水解糖、淀粉糖衍生物和其它发酵产品。

由于新普鲁兰酶能参与淀粉水解的四种反应，所以在淀粉加工业中有着重要的用途：1、提高淀粉的利用率。在淀粉糖化过程中辅助性的加入新普鲁兰酶，可水解残余的α-(1→6) 糖苷键支链糖，提高淀粉糖的转化率。在以淀粉生产酒精的工艺中，添加新普鲁兰酶可将淀粉的利用率提高3%～5%。2、用于低聚糖的生产。如低聚异麦芽糖生产是α-淀粉酶、β-淀粉酶、转糖苷酶协同作用，使淀粉先水解然后再经过转糖苷作用生成低聚异麦芽糖，在低聚糖的生产中用新普鲁兰酶替代其它转糖苷酶，可将低聚糖的转化率由原来的45%提高到60%左右。3、在葡萄糖苷酶催化机制研究中的作用。新普鲁兰酶能催化四种淀粉的水解反应，在葡萄糖苷酶家族中是独一无二的，因此，它的一级结构、二级结构，三级结构的研究并与其他相关的酶比较研究就显得尤为重要，不同来源的新普鲁兰酶是否具有同样的性质，研究它们的同源性比较及与淀粉酶家族的同源性比较有着重要意义。

新普鲁兰酶工业化生产菌种极少，目前为止，国外研究开发的菌种只有五到六种，文献报道的主要菌种有嗜热脂肪芽孢杆菌 TRS40 (Bacillus stearothermophilusTRS40) 、普通高温放线菌R247 (Thermoactinomyces vulgaris R247)、嗜碱性芽孢杆菌(Alkalophilic Bacillus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、环脂酸芽孢杆菌 (Alicyclobacillus acidocaldarius)等，大多数菌种都处于菌种选育与理论研究阶段，而国内在这方面的研究还未见报道。淀粉水解酶在淀粉水解糖、淀粉糖衍生物和淀粉发酵产品生产中起着决定性的作用。性能稳定、酶活力高、多功能的新普鲁兰酶产品开发和利用可大幅度提高淀粉转化率，具有显著的经济效益，同时还可增加淀粉用途，生产出新品种，促进淀粉加工业的快速发展。

发明内容

基于上述，本发明的目的在于提供一种新普鲁兰酶的制备和分离方法。

本发明采用的微生物菌种为中国普通微生物保藏管理中心保藏的嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus Typestrain ），保藏编号为CGMCC1.1923。

本发明以初始的嗜热脂肪芽孢杆菌为出发菌种，经培养，筛选，液体发酵培养后得到一定密度的菌细胞培养液，然后经离心、细胞破碎、硫酸铵盐析、柱层析分离后得到液体新普鲁兰酶。下面进行详细分述：

一种新普鲁兰酶的制备和分离方法，其步骤分为：

1. 试管斜面培养