[发明专利]一种周年大规模转化玉米的方法

说明书

技术领域

本发明所属的技术领域是农业生物技术领域和作物育种领域。

背景技术

玉米是世界上最重要的三大粮食作物之一，也是重要的工业原料和生物能源物质，在我国乃至全世界的粮食生产中都占有举足轻重的地位。在提高玉米单产的诸多因素中，新品种选育的作用约占40%。随着分子生物学技术的长足发展，转基因技术开始在玉米新品种选育中发挥重要的作用。

转基因技术是根据育种目标，利用现代生物技术手段从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化导入受体作物，经过筛选获得稳定表达的转基因株系，结合田间试验与大田选择育成转基因新品种或新种质。转基因育种最大的优点是针对性很强，可以根据目标性状定向选择合适的基因导入需要改良的作物中，以达到预期的目的。通过转基因技术的应用，不仅可以提升传统育种的研发效率，而且提升了育种研发的准确率、减少盲目性和重复浪费，丰富了传统的育种手段，使作物育种的产业发展水平迈向新的台阶。目前，转基因育种在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中已经取得了巨大的成功，其中，转基因玉米已经成为仅次于转基因大豆的全球种植面积第二大的转基因作物。

在研发转基因作物新品种时，最重要的技术环节之一就是作物遗传转化技术。目前玉米最常用的遗传转化方法主要是农杆菌介导法，所用的材料可分为幼胚和非幼胚类型，其中前者还包括直接用幼胚或幼胚诱导的胚性愈伤组织进行遗传转化，而后者包括直接用茎尖分生组织和利用成熟胚、叶片、茎尖等诱导的胚性愈伤组织等作为材料进行再生。

幼胚和幼胚诱导的胚性愈伤组织操作相对简单，植株再生相对比较容易，转化率也较高，是玉米转基因中最常用的受体材料。但是幼胚转化所用的受体材料基因型限制严重、材料易受季节和温室条件限制，不能够持续不断的高通量的进行玉米转化，在产业化应用上具有很大的局限性。

非幼胚类型的材料中，直接用茎尖分生组织虽然转化和再生容易，且不受基因型限制，但转化率低，获得的再生植株大多是嵌合体，后代需要做大量的筛选工作。而采用成熟胚、叶片、茎尖等材料较难诱导出胚性愈伤组织，再生较困难。玉米胚芽鞘节作为材料进行转化相对于幼胚而言，转化效率较低。但是由于其不受温室条件和生长季节的限制，操作简便，可以实现高通量、持续不断的遗传转化，因而在玉米的商业化转基因研发中，具有相当大的应用潜力。

由于转基因植物目前尚无法实现定点整合，因此只有获得大量的转基因植株才能够提高获得理想目标性状的几率。而由于上述原因，目前我国的玉米转基因规模一直偏小，转化率偏低，从而无法筛选出优良目标性状的单株，严重阻碍了转基因玉米向产业化方向发展。本专利发明将幼胚转化和胚芽鞘节愈伤组织转化巧妙地结合起来，有效地克服了取材困难、转化周期短等缺点，为玉米转基因产业化奠定了坚实的基础。

发明内容

本发明的目的提供一种周年连续大规模转化玉米的方法，将幼胚和胚芽鞘节诱导愈伤组织为外植体的两种转化方法结合，主要包括以下步骤：

1）在玉米生长季节分批播种玉米受体材料，间隔4-7天播种一次；

2）将上述步骤1）中播种的玉米在散粉前严格套袋，自交或姊妹交，每天将授粉株数控制在相同的数量；

3）上述步骤2）中授粉的玉米在授粉后9-13天，幼胚长至1.5-2.0mm时，剥取幼胚进行根癌农杆菌介导的转化，将幼胚放入侵染液中侵染，置于共培养培养基上培养，移入恢复培养基上暗培养一周，随后移入筛选培养基上筛选2－4轮，在胚状体诱导培养基上诱导形成胚状体，转入到分化培养基上进行分化，再生幼苗；

4）在当年无法获得上述步骤3）的幼胚的时间段里，将灭菌的玉米种子置于发芽培养基中培养，萌发获得幼苗；

5）将上述步骤4）中得到的幼苗切取胚芽鞘节，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；

6）将上述步骤5）中得到的愈伤组织在愈伤组织诱导培养基上进行继代；

7）用农杆菌介导法将外源基因转化上述步骤6）中的愈伤组织；

8）将上述步骤7）中得到的愈伤组织置于胚状体诱导培养基中，得到玉米愈伤组织胚状体；

9）将上述步骤8）中得到的愈伤组织胚状体置于再生培养基中，得到再生苗；

10）将上述步骤3）和9）中得到的再生苗置于生根培养基中，获得具有3-4条根的玉米再生植株；

上述的浸染液是N6＋蔗糖68.5g/L＋葡萄糖36g/L＋L-脯氨酸0.7g/L＋2,4-D 1.5mg/L；