[发明专利]一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，属于基因克隆领域。

背景技术

遗传工程涉及大量将DNA片段在不同的物种或细胞间转移的操作，其中一个基本的步骤，就是将得到的DNA片段——无论它们是经过PCR扩增还是别的手段产生——插入到克隆载体中形成重组质粒。该重组质粒能够在细胞或者微生物的体内增殖，使得该DNA片段能长期保存，扩增，以便于后续研究。

1991年，Holton.T.A和Graham M.W.等发明了“T-A”克隆方法。其原理是，用taq DNA聚合酶扩增的DNA，其3端都有突出一个腺嘌呤脱氧核苷酸（简称A）；因此，研究人员研制出一种3端有突出一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸（简称T）的线性载体。载体和PCR产物的末端形成一对互补碱基，经T4DNA连接酶作用，两个线性DNA分子形成一个闭合的环状分子。这种闭合的环状分子成功转化感受态的大肠杆菌后，就能得到稳定的重组质粒。这种预制的线性载体被称简称为T载体。T载体的使用大大提高了DNA的连接效率，长期以来得到广泛的使用，但是也有几个明显的缺点：

第一，连接时间长。为了在转化后得到更多的克隆数和更高的阳性率，通常T载体和插入片段需要用T4DNA连接酶在室温连接12-16个小时。这一步花费了很长的实验时间。

第二，只有taq DNA聚合酶扩增的DNA片段带有悬挂的A，而对高保真DNA聚合酶的扩增产物，是不含悬挂A的平端PCR产物。这类DNA分子需要用taq酶处理，使其3端加上一个腺嘌呤脱氧核苷酸，才能和T载体连接（通常简称为加A反应）。因此，在用T4噬菌体DNA连接酶作用之前，平端PCR产物要经过加A反应和核酸纯化两个步骤。这两步操作耗时长达3－5个小时，同时也损耗了一部分DNA，极大地降低了克隆效率。

上述的加A反应和连接反应，必须经过两步处理，是因为加A反应使用的taq DNA聚合酶，反应缓冲液最佳pH在8.3－9.0之间，连接反应使用的T4噬菌体DNA聚合酶，反应缓冲液最佳pH在7.5－8.0之间。这两种酶在对方的工作缓冲液都没有活性。因此，针对上述缺点，我们产生了本发明。

发明内容

本发明的目的是提出一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，使用一种通用缓冲液，将双链DNA片段快速连接到克隆载体上，省略已有的两个酶反应之间DNA分子的核酸的纯化步骤，以提高实验效率。

本发明提出的使用通用缓冲液快速克隆基因的方法，包括以下步骤：

（1）制备一种通用缓冲液，该通用缓冲液中各组分的摩尔浓度为：

三羟甲基氨基甲烷（Tris），浓度为250－500毫摩尔/升，

氯化镁（MgCl2），浓度为10－20毫摩尔/升，

二硫苏糖醇（DTT），浓度为10－20毫摩尔/升，

三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（ATP），浓度为5—10毫摩尔/升，

三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP），浓度为100－200微摩尔/升，

氯化六氨合高钴（Hexamminecobalt(III)Chloride），浓度为50—100微摩尔/升，

用盐酸将通用缓冲液的pH值调至8.0；

（2）用高保真DNA聚合酶（如pfu DNA polymerase）通过聚合酶链式反应（PCR）得到双链DNA片段溶液；

（3）取2微升步骤（1）的通用缓冲液，加入5微升步骤（2）得到的双链DNA溶液，再加入1微升体积浓度为3单位/微升的Taq DNA聚合酶，在68－74℃下作用5—10分钟，形成含有3末端含有未配对的三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸（dATP）的粘端DNA分子溶液；

（4）在步骤（3）的反应体系中加入1微升浓度为50纳克/微升的三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸载体（T载体）和1微升浓度为5单位/微升的T4噬菌体DNA连接酶，室温下反应5－30分钟，使粘端DNA分子和载体DNA分子形成环状的DNA质粒，成为连接产物；

（5）取5微升步骤（4）得到的连接产物，置于50微升感受态大肠杆菌细胞溶液，冰浴30分钟，在42℃热处理90秒，冰浴2分钟，再加入200－500微升细菌液体培养基，在37℃摇床上以200转/分的速度培养45分钟后，从中取出200－400微升菌液涂布于含有1毫克异丙基β—D—硫代半乳糖苷（IPTG）和0.8毫克5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷（Xgal）的固体培养基平板上，在37℃温箱培养12－16小时，在平板上克隆出白色和蓝色的大肠杆菌细菌菌落。