[发明专利]一种蔗糖异构酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种蔗糖异构酶的制备方法。

背景技术

异麦芽酮糖的化学名称叫α-D-吡喃葡萄糖苷-1,6-D-呋喃果糖，具有与蔗糖相似的甜味特性，无异味，甜度是蔗糖的50%。异麦芽酮糖不但具有非致龋齿性，而且还能够阻止产生不溶性葡聚糖以防龋齿形成。由于人体本身无法消化异麦芽酮糖，只有被肠道微生物缓慢分解后才能进入血液而被人体吸收，因此，食用后在血液中释放单糖的速度比蔗糖慢且不刺激胰岛素分泌，因而有益于糖尿病防治。大多数细菌和酵母都不能利用异麦芽酮糖，当异麦芽酮糖应用于发酵食品和饮料生产时，其抗微生物特性使产品的甜味易于保持。

异麦芽酮糖是以蔗糖为原料，经蔗糖异构酶（α-葡糖基转移酶，EC.5.4.99.11）催化反应，将蔗糖转化为异麦芽酮糖的，由蔗糖异构酶催化的蔗糖异构化反应如图1所示。在异构化过程中，蔗糖分子中的α-1,2-糖苷键在蔗糖异构酶活性中心内首先被水解断开并转位，随后葡萄糖单体再与果糖单体形成α-1,6-或α-1,1-糖苷键，并从酶分子中脱落而产生两种蔗糖异构体——异麦芽酮糖和海藻酮糖，同时，断开的α-1,2-糖苷键也可以与水分子反应形成葡萄糖和果糖。因此，在蔗糖异构化过程中，除了生成α-1,6-连接的异麦芽酮糖外，也形成α-1,1-连接的海藻酮糖，同时还会形成一部分非连接的葡萄糖和果糖。所以，产物中除了异麦芽酮糖外，还伴随有三种副产品即海藻酮糖、葡萄糖和果糖的形成，其中海藻酮糖与异麦芽酮糖具有类似的生理功能，是一种非致龃齿糖且糖尿病人可食用，因此海藻酮糖不影响异麦芽酮糖的特殊品质，生产过程中无需考虑分离剔除。但是，这些蔗糖异构酶的转化产物中还含有2～7％的葡萄糖和果糖等副产物，严重影响异麦芽酮糖产品的质量，在后提取过程中必须要分离除去。生产过程中必须采用离子交换树脂等复杂的分离纯化过程除去这些杂质，导致生产成本大幅提高和大量用水，是一个值得考虑的工业化问题。

为了解决上述问题，我们通过对蔗糖异构酶催化反应过程的比较分析，发现蔗糖异构酶的存在形态影响蔗糖异构化产物的比率。与其它存在形态的蔗糖异构酶比较，当采用细胞融合蔗糖异构酶时，所催化的蔗糖异构化产物中完全不形成葡萄糖和果糖，为避免上述异麦芽酮糖生产中的工业化问题提供了解决方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种蔗糖异构酶的制备方法，采用本发明制备的蔗糖异构酶，蔗糖转化率为99.8％以上，转化产物中的异麦芽酮糖含量为88.39％，葡萄糖和果糖的含量低于检测限。

本发明中所述甘蔗克雷伯菌（Klebsiella sugarcanna），在2013年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013153，保藏单位地址为：武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编：430072。

本发明的具体操作步骤如下：

第一步：种子活化

取出4°C冰箱保藏的克雷伯菌CCTCC M2013153菌保存斜面，在无菌操作条件下，用接种环接种1～2环到含有25毫升种子培养基的三角瓶中，在30°C、150转/分钟条件下，于摇床内振荡培养10～12小时，待种子活化液在600nm波长处的吸光度值为0.8～1.0时，停止培养。

种子培养基配方组成为：1～2g蔗糖，0.2～0.4g酵母粉，0.1～0.3g蛋白胨，0.03～0.07g硫酸镁，0.05～0.15g磷酸二氢钠，0.05～0.15g硝酸钠，100mL水，pH6.8～7.2。

第二步：种子培养液制备

在无菌操作条件下，按3～5%接种量，将种子活化液转接到含有50毫升种子培养基的三角瓶中，在30°C、150转/分钟条件下，于摇床内振荡培养4～6小时，待种子培养液在600nm波长处的吸光度值为0.8～1.0时，停止培养。

种子培养基配方组成与第一步中的相同。

第三步：蔗糖异构酶生产

按3～5％接种量，将种子培养液转接于含有150～200mL发酵培养基的三角瓶中，在30°C、150转/分钟的条件下，于摇床中振荡培养10～12小时，每隔3小时取样，检测发酵液中的酶活力，当酶活力达到最大值并稳定后，停止培养。

发酵培养基组成配方为：3～5g蔗糖，0.1～0.3g酵母浸粉，0.1～0.2g蛋白胨，100mL水，pH6.8～7.2。

第三步：菌体收集