[发明专利]一种免疫增强型抗大肠杆菌ETEC重组乳酸菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及融合基因DC-pep-FaeG，一种重组DC-pep-FaeG的乳酸菌表达质粒pW425et-DC-pep-FaeG，一种免疫增强型抗大肠杆菌（ETEC）重组乳酸菌及其制备方法。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是常见的病原性大肠杆菌，由ETEC引起的仔猪腹泻病发病迅速，发病率和死亡率均较高，是造成养猪业重大经济损失的疾病之一，研究和创制该种疫苗是预防本病发生发展、促进健康养殖的重要保障。

ETEC感染仔猪后，首先通过粘附素与小肠上皮细胞的特异性受体结合，促使ETEC在小肠内定居、繁殖，然后分泌肠毒素引起肠上皮细胞产生一系列的病理变化，从而扰乱细胞内水和电解质的平衡，最后导致仔猪发病甚至死亡。在这个过程中，粘附素介导了大肠杆菌与肠上皮受体结合，构成了ETEC致病的首要条件。粘附素主要是指细菌表面的菌毛，是一种丝状的多聚蛋白结构，介导细菌粘附宿主细胞。K88菌毛是构成粘附素的重要物质，主要由FaeG和一些小亚基构成，FaeG是由数百个重复的蛋白亚单位组成，是K88菌毛的主要蛋白亚基，也是其粘附亚基，促使细菌与小肠粘膜上皮细胞的特异性受体结合，导致K88(+)ETEC在肠道内定植，然后产生毒素，致使仔猪发生腹泻。由于K88(+)ETEC的流行较为普遍，对K88的研究也相对广泛，因此利用K88菌毛研制粘附素疫苗对预防仔猪大肠杆菌腹泻病具有重要意义。Vanden Broeck利用纯化的K88菌毛抗原经口服免疫含有K88受体的仔猪，在其肠道内诱导K88的特异性免疫反应，在血清中检测到IgA和IgM抗体，有效预防了K88(+)ETEC的侵袭。

众所周知，树突状细胞（DCs）是机体功能最强大免疫递呈细胞，DCs在启动获得性免疫中发挥着关键性作用，DCs接触抗原后，对抗原进行识别、捕获和加工，并形成MHC-抗原肽复合物以启动机体的细胞免疫和体液免疫应答。肠道粘膜免疫系统由上皮内淋巴细胞、固有层淋巴细胞和Peyer^，s Patches(PP)等肠相关淋巴组织构成。在肠道内的很多组织区室已经鉴定出了具有专门抗原提呈作用的DCs，包括粘膜固有层(LP)，滤泡相关肠上皮下穹隆，粘膜相关淋巴组织的T细胞丰富区，位于上皮细胞或其下方的DCs可通过M细胞捕捉穿越上皮细胞的各种细菌抗原。因此，DCs对免疫原的识别是疫苗发挥作用的免疫学基础。

树突状细胞诱导肽(DC-targeting peptide,DCpep)是由36个碱基组成的短肽，具有特异性靶向结合DCs的作用，有助于DCs直接、有效的识别并捕获目的抗原，引发肠道内高效的粘膜免疫反应，从而指导和调节获得性免疫。已有研究证实针对丙型肝炎病毒抗原融合DCpep作用于DCs，结果表明诱发机体产生了高效的抗原特异性免疫反应，并发现抗原融合DCpep没有修改DCs的表型和功能，而是介导DCs靶向识别抗原，强化抗原的成熟。

乳酸菌作为体内重要的益生菌，已被国际公认为“安全级”的微生物，利用乳酸菌的这一优势，采用重组DNA技术，构建可稳定表达DCpep与抗原肽融合的重组乳酸菌，在创制口服疫苗方面具有重要的现实意义和潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫增强型预防产肠毒素大肠杆菌（ETEC）感染的重组乳酸菌。

一种融合基因DC-pep-FaeG，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示；

一种融合基因DC-pep-FaeG的制备方法，它包括：

提取ETEC CVCC₂₀₀的内源性质粒，并以其为模板，用引物：

P1： ACAGGTACCATGAAAAAGACTCTGATTGC；

P2：CGAAGCTTTTATGGACGTTGTGGAGTTGAATGGTATGATGGGTAGAATTA

GTAATAAGT；

　　PCR方法扩增。

一种重组DC-pep-FaeG的乳酸菌表达质粒pW425et-DC-pep-FaeG，它是在表达载体pW425et上插入了其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示的基因；

一种免疫增强型抗产肠毒素大肠杆菌感染的重组乳酸菌，它是转化了pW425et-DC-pep-FaeG的乳酸杆菌。

所述的乳酸杆菌为植物乳酸杆菌。