[发明专利]一种用渐尖毛蕨修复土壤重金属锌污染的方法

权利要求书

1.一种用渐尖毛蕨修复土壤重金属锌污染的方法，其特征是该方法包括如下步骤：

一、证明渐尖毛蕨对重金属锌存在修复能力；

二、证明渐尖毛蕨对重金属锌胁迫的安全性。

2.根据权利要求1所述的一种用渐尖毛蕨修复土壤重金属锌污染的方法，其特征是所述的步骤一证明渐尖毛蕨对重金属锌存在修复能力；具体包括，

一、实验处理设计：

1）取16株根际长度与株高相近，刚长出 1-2 片小羽叶的渐尖毛蕨幼苗为一组，分四组进行实验，根部用蒸馏水洗净，然后再用去离子水冲洗一遍，移入事先装上 500g草炭营养基质的塑料盆中，该盆规格为25×15cm，所述的培养基质由BALTISCHES SUBSTRAT草炭营养土、蛭石、珍珠岩混合均匀，它们间的重量百分比为BALTISCHES SUBSTRAT草炭营养土：蛭石:珍珠岩=1:1:1；

2）将药品七水合硫酸锌，直接添加到上述的培养基质中，用去离子水淋溶 3 天并混合均匀；

各处理组药品添加量，各处理重复 4 次， Zn对渐尖毛蕨的浓度的具体处理方法如下：

第一组为对照组（CK）,不添加药品七水合硫酸锌；

第二组添加药品七水合硫酸锌，其质量浓度为500mg/kg；

第三组添加药品七水合硫酸锌，其质量浓度为1000mg/kg；

第四组添加药品七水合硫酸锌，其质量浓度为2000mg/kg；

二、实验证明渐尖毛蕨对重金属锌的吸附：

渐尖毛蕨器官中锌浓度的测定，材料收割时，将植株分为根、叶柄、羽叶三部分，用去离子水冲洗2次后放入培养皿中，于 80℃的烘箱中杀青15分钟，60℃下烘至恒重后，精确称取渐尖毛蕨的根、叶柄、羽叶各0.100g放于100ml 的三角烧瓶中，并加入10 mL的密度为1.42g/mL的HNO₃和 2mL 的密度为1.76g／mL的HClO₄， 以不加材料的混合酸组作空白校正，每个样品重复 3 次，摇匀过夜，在电热板上缓慢加热消煮至白烟冒尽，液体变清亮为止， 用去离子水定容至 25 ml，使用ICP-MS仪测定，元素含量用相应器官的干重计，数据结果如下：

在第一组对照组（CK）中，羽叶中Zn元素浓度为8.65±0.44a mgkg^-1DW，叶柄中Zn元素浓度为1.71±0.11a mgkg^-1DW，根中Zn元素浓度为3.15±0.12a mgkg^-1DW；

在第二组中，羽叶中Zn元素浓度为30.41±10.75a mgkg^-1DW，叶柄中Zn元素浓度为14.72±1.80a mgkg^-1DW，根中Zn元素浓度为30.22±10.77a mgkg^-1DW；

在第三组中，羽叶中Zn元素浓度为38.18±6.25a mgkg^-1DW，叶柄中Zn元素浓度为20.17±0.38a mgkg^-1DW，根中Zn元素浓度为34.64±8.48a mgkg^-1DW；

在第四组中，羽叶中Zn元素浓度为50.83±8.09a mgkg^-1DW，叶柄中Zn元素浓度为48.56±12.31a mgkg^-1DW，根中Zn元素浓度为59.95±3.12a mgkg^-1DW；

研究植物对重金属污染土壤进行修复，不仅要看植物对重金属的耐性和吸收累积能力，还应考虑其向地上部转运重金属的能力；富集系数BF反映了重金属在土壤－植物体系中迁移的难易程度；迁移系数TF通常能够反映出重金属在植物体内的运输与分配情况，在数值特征上反映植物对重金属从地下部分向地上部分转运的能力；渐尖毛蕨对锌的富集系数BF和迁移系数TF结果统计如下：

在第一组（Zn浓度（500mg/kg）），渐尖毛蕨对锌的富集系数BF为0.16、迁移系数TF为2.19；

在第二组（Zn浓度（1000mg/kg）），渐尖毛蕨对锌的富集系数BF为0.10、迁移系数TF为2.24；

在第三组（Zn浓度（2000mg/kg）），渐尖毛蕨对锌的富集系数BF为0.09、迁移系数TF为1.79；浓度=平均值±标准差，n=3

上述数据表明：渐尖毛蕨对锌的富集系数不高，但迁移系数较高，说明渐尖毛蕨将从土壤吸附的重金属锌转移入渐尖毛蕨自身地上部分叶片和茎中储存，也有一部分储存在根中，可见渐尖毛蕨对土壤中的锌是有效的吸附材料，并且渐尖毛蕨在环境中的生物量较大，可以通过种群优势来进行实地操作，由此可说明渐尖毛蕨对土壤锌污染是具有有效的修复意义。

3.根据权利要求1所述的一种用渐尖毛蕨修复土壤重金属锌污染的方法，其特征是所述的步骤二、证明渐尖毛蕨对重金属锌胁迫的安全性，具体包括，

一、实验准备，

对渐尖毛蕨亚细胞水平锌分布的测定，取渐尖毛蕨的根、叶柄、羽叶鲜样用去离子水冲洗 2 次；各个部分分别称取 0.500g，用 10ml 的预冷的匀浆液，该匀浆液组成为:0.25mmol/L蔗糖、50mmol/L顺丁烯二酸盐缓冲液，pH 为7.8；1mmol/L MgCl₂和 10mmol/L 半胱氨酸，匀浆液的 pH 为 7.8；所有匀浆过程和分离过程温度均控制在 4℃；

二、具体实验步骤如下：

1）匀浆液及组织的体积为 10ml，然后转入两支 5ml 离心管中；

2）将组织匀浆液在高速冷冻离心机中用 300r/min转速离心40s，下部沉淀、底层碎片为细胞壁组分；

3）上清液以 20000r/min离心 45 min，底层碎片为细胞器组分，上层清液为胞液组分，包括胞液及液泡内大分子有机物及无机离子；

4）将分离后的细胞壁、胞液和细胞器组分采用体积比为 HNO₃:HClO₄=5:1的方法消煮后待测，元素含量用相应器官的干重计；数据结果如下：

在第一组对照组（CK）的羽叶中，胞液中Zn元素浓度为2.59±1.01a mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为4.88±0.86b mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为1.54±0.45a mg/kg DW；

在第二组（Zn浓度 500mg/kg）的羽叶中，胞液中Zn元素浓度为7.04±0.38c mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为13.15±0.49a mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为3.27±0.29a mg/kg DW；

在第三组（Zn浓度 1000mg/kg）的羽叶中，胞液中Zn元素浓度为12.02±2.89b mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为18.51±0.82c mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为6.38±1.11a mg/kg DW；

在第四组（Zn浓度 2000mg/kg）的羽叶中，胞液中Zn元素浓度为17.84±0.59c mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为20.36±0.29a mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为12.02±2.19b mg/kg DW；

在第一组对照组（CK）的茎中，胞液中Zn元素浓度为1.84±0.58a mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为3.04±0.96a mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为1.52±0.12a mg/kg DW；

在第二组（Zn浓度 500mg/kg）的茎中，胞液中Zn元素浓度为6.80±1.01a mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为6.68±1.35a mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为3.04±0.21a mg/kg DW；

在第三组（Zn浓度 1000mg/kg）的茎中，胞液中Zn元素浓度为11.24±1.68ab mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为10.92±1.93a mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为4.96±1.67a mg/kg DW；

在第四组（Zn浓度 2000mg/kg）的茎中，胞液中Zn元素浓度为17.28±2.91b mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为18.12±5.11b mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为11.56±2.97a mg/kg DW；

在第一组对照组（CK）的根中，胞液中Zn元素浓度为3.12±0.50a mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为2.64±1.00a mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为1.72±0.76a mg/kg DW；

在第二组（Zn浓度 500mg/kg）的根中，胞液中Zn元素浓度为8.64±0.65ab mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为13.20±1.31a mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为4.84±0.49b mg/kg DW；

在第三组（Zn浓度1000mg/kg）的根中，胞液中Zn元素浓度为15.56±1.12ab mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为22.40±1.75a mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为7.88±0.35b mg/kg DW；

在第四组（Zn浓度 2000mg/kg）的根中，胞液中Zn元素浓度为23.12±3.60b mg/kg DW，细胞壁中Zn元素浓度为37.32±2.26b mg/kg DW，细胞器Zn元素浓度为10.12±1.63c mg/kg DW；浓度=平均值±标准差，n=3

通过上述数据可知，在亚细胞水平，渐尖毛蕨累积的锌主要集中在胞液和细胞壁里，随浓度升高，液泡和细胞壁水平锌浓度积累增加；同时，在羽叶和茎中重金属锌的累积是对锌污染治理的理想表现，从而说明了渐尖毛蕨是改善土壤重金属锌污染的一种可行性材料；

同时后期观察，28、56天后，胁迫后的渐尖毛蕨仍能萌出新拳卷叶，证明渐尖毛蕨对重金属锌存在抗性，虽然未达到超富集水平，但通过轮伐处理，可以实现治理土壤锌污染的问题。