[发明专利]纳豆激酶的提纯方法及制备方法

权利要求书

1.一种纳豆激酶的提纯方法，包括以下步骤：

1）提取：将纳豆菌发酵液或粗纳豆激酶溶液进行2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液；

2）超过滤：将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液；

3）葡聚糖凝胶G-50柱层析：

用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱，取所述超滤浓缩液上样，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，并浓缩至原体积的1/3，得第一浓缩液；

4）Amberlite IRC-50阳离子交换柱层析：

装柱，取所述第一浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液透析，浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液；

5）DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析：

装柱，取所述第二浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为pH8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，浓缩至原体积的1/3，得第三浓缩液；

6）将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4℃下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集结晶粉末，得纳豆激酶酶蛋白结晶。

2.一种纳豆激酶的制备方法，包括以下步骤：

1）种子菌制备：

101）菌种活化:将纳豆菌转移至斜面培养基，35℃培养24h；

102）种子液制备：取一环活化菌种，接入装有500mL种子培养基的1000mL锥形瓶，在温度为35℃和摇床转速为140r/min的条件下培养24h，得种子液；

103）种子扩大培养：在10L种子罐中装入5L种子培养基，灭菌并冷却后接入750mL种子液，并加入2-3mL豆油，通入无菌空气，控制温度在35℃，培养24h，得二级种子菌；

2）纳豆菌液体发酵：

在100L发酵罐中装入40L发酵培养基，灭菌冷却后接入6L二级种子菌，并加入20mL豆油，通入无菌空气，控制温度在35℃，培养24h，得纳豆菌发酵液；

其中，所述斜面培养基为营养琼脂；种子培养基的组分为：蛋白胨1.5%、葡萄糖1.5%、氯化钠0.5%，种子培养基的pH值为7.5；发酵培养基的组分为：蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、磷酸氢二钾0.4%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、大豆1%、玉米0.2%、蚕蛹粉0.2%，发酵培养基的pH值为7.5；

3）提取：将纳豆菌发酵液进行2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液；

4）超过滤：将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液；

5）葡聚糖凝胶G-50柱层析：

用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱，取所述超滤浓缩液上样，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，并浓缩至原体积的1/3，得第一浓缩液；

6）Amberlite IRC-50阳离子交换柱层析：

装柱，取所述第一浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液；

7）DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析：

装柱，取所述第二浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为pH8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，浓缩至原体积的1/3，得第三浓缩液；

8）将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4℃下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集结晶粉末，得纳豆激酶酶蛋白结晶。