[发明专利]一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒

权利要求书

1.一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒,其特征在于，该试剂盒由定量RT-PCR反应液管（1）、酶混合液管（2）、引物探针混合液管（3）、4个标准品管（4）、4个阳性对照品管（5）、阴性对照品管（6）和盒体（7）组成，定量RT-PCR反应液管（1）装有定量RT-PCR反应液，酶混合液管（2）装有酶混合液，引物探针混合液管（3）装有引物探针混合液，4个标准品管（4）分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P，4个阳性对照品管（5）分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品；

其中定量RT-PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含四组引物和相应的四种不同荧光标记的探针，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品；

荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：

上游引物Influenza A-F: 5’- GGARTGGMTAAAGACAAGACCAATC-3’

下游引物Influenza A-R：5’- GGCRTTYTGGACAAASCGTCTAC-3’

特异性探针Influenza A-P: 5’-ROX-AGTCCTCGCTCACTGGGCACGGT-BHQ2-3’

上游引物H7-F: 5’- GAGGCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3’

下游引物H7-R: 5’- CCGAAGCTAAACCARAGTATCACA-3’

特异性探针H7-P: 5’-FAM- ACCCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTAYAA--BHQ1-3’

上游引物N9-F: 5’- GCCCTGATAAGCTGGCCACT-3’

下游引物N9-R: 5- ACTAGTACTTGACCAMCCAATGCA-3’

特异性探针N9-P: 5’-VIC- TCACCRCCCACAGTRTACAAYAGCA-BHQ1-3’

上游引物RNase P-F: 5’- AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’

下游引物RNase P-R：5’- GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’

特异性探针RNase P-P: 5’-CY5- TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’

 所述标准品包括甲型流感病毒、H7、N9及核酶RNase P标准品，其保守区基因序列如下：

甲型流感病毒标准品序列为：

CGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGGTTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAACGCCCTAAATGGGAATGG

H7标准品序列为：

CACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACT

N9标准品序列为：

GATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACCGCCCACAGTGTACAACAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCAAGTACTAGTTGCCATGATGGCAAATCCAGG

RNase P标准品序列为：

CTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTGGTTGC 

所述甲型流感病毒、H7、N9及RNase P的特异性探针分别采用ROX、FAM、VIC和CY5四种不同荧光标记。