[发明专利]利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测糖化血红蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测糖化血红蛋白的方法，特别涉及一种利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测待测样品中糖化血红蛋白含量方法。

背景技术

糖化血红蛋白（缩写作hemoglobin A1c、HbA_1c、A1C或HbA1c）是血液红细胞中的血红蛋白与葡萄糖结合的产物，可以反映测定前6-8周患者体内平均血糖水平，通常作为监测糖尿病患者体内血糖控制情况与疗效观察的参考标准，一般来说血红蛋白被糖基化的比例与一段时间内体内血糖浓度的水平呈正比。对应的，非糖化血红蛋白用HbA0表示。目前，国际上定义HbA_1c化学构成为葡萄糖稳定的连接在血红蛋白β链N末端缬氨酸(Val)残基上，即血红蛋白（血液）-N-（1-脱氧果糖基）血红蛋白β链(βN-1-deoxyfructosyl-hemoglobin)。

葡萄糖进入红细胞后与血红蛋白HbA的β链N末端缬氨酸残基缩合，先形成一种不稳定的Schiff碱（醛亚胺结构），即前HbA_1c，再解离或经Amadori分子重排后形成HbA_1c（醛酮结构），此反应的过程是缓慢和不可逆的，并且由于红细胞内没有分解醛酮的酶，因此HbA_1c浓度只与红细胞寿命和该时期体内血糖的平均浓度有关，不受运动或食物的影响，反映的是过去6-8周的平均血糖浓度，是目前国际上公认的用于评估糖尿病患者长期血糖状况的金标准。

目前有超过20种不同的方法用于测量HbA_1c，其主要的检测原理主要有如下3种：

（1）离子交换层析法：它是基于不同组分的电荷差异进行分离的。葡萄糖与Hb的β链N末端Val连接降低了等电点，导致糖化Hb带的正电荷比未糖化Hb的少，与树脂的附着力小，可以分别用不同离子浓度的缓冲液在不同的时间将Hb从阳离子交换柱中洗脱下来，再根据每个峰值下的面积来计算HbA_1c占总Hb的比例。但是该方法中Hb变异体会随HbA_1c一起洗脱，影响HbA_1c值，离子交换层析法受温度、pH值、抗凝剂和柱效的影响较大，从而使结果产生偏差。常规的离子交换HPLC法经过多年技术上的改进，检测精密度（CV）<1%、分辨率及抵抗多种糖化血红蛋白变异体的能力有了明显提高，基本可以达到临床需求，美国糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)的参考实验室也是使用Bio-Rex70阳离子交换树脂HPLC作为常规实验标准参考方法，但是非特异性的问题仍然不能完全克服。

（2）亲和层析法：用于分离糖化与非糖化血红蛋白的亲和层析凝胶柱是交联了间氨基苯硼酸的琼脂糖珠。硼酸具有与整合在血红蛋白分子上葡萄糖的顺位二醇基作可逆结合反应的性质，致使HbA_1c选择性地结合于柱上，而非糖化血红蛋白被洗脱，然后变换条件，又可以将HbA_1c重新解离，获得纯化。除葡萄糖外，血液中其他糖类都可与硼酸基结合，因此该方法的检测结果为GHb总量，而不是HbA_1c的含量，该方法不受温度、GHb变异体的影响，通过校准，其结果与离子交换法有良好的相关性，已被临床广泛采用。但该实验测定结果受到除血红蛋白β链N末端缬氨酸残基以外糖基化的影响。