[发明专利]快速检测转玉米PEPC基因作物的ELISA试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于快速检测玉米PEPC基因表达蛋白的ELISA试剂盒，包括：

1） 96孔酶标板：包被玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因PEPC蛋白多克隆抗体的酶标板，包被浓度1：1600-1：3200；

2） 玉米PEPC蛋白单克隆抗体：保藏号是CCTCC NO：C2012199，鼠杂交瘤细胞4E5制备的单克隆抗体；

3） 酶标二抗：辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG，工作效价1：5000-1：10000；

4） 阴性对照品：未转玉米PEPC基因的水稻蛋白提取液；

5） 样品处理液：50mmol·L^-1 Tris-HCL，pH7.5，1mmol·L^-1 MgCl₂，5mmol·L^-1二硫苏糖醇DTT，质量比2%聚乙烯吡咯烷酮PVP，质量比10%甘油；

6） 稀释液为磷酸盐缓冲液PBS 0.01M，pH7.5；

7） 洗涤液为磷酸盐吐温缓冲液PBST：1000mL 0.01M PBS中加0.5mL Tween-20；

8） 底物溶液：

底物缓冲液: Na₂HPO₄·12H₂O  0.2g；NaH₂PO₄·2H₂O 6.84g，双蒸水500 mL；4℃保存备用；

TMB母液：TMB 40mg； DMSO 5mL；避光4℃保存备用；

双蒸水配制的体积比1% H₂O₂。

2. 权利要求1所述玉米PEPC基因表达蛋白ELISA试剂盒的使用方法，包括：

1） 将0.1g的植物样品在加有预冷的1mL的样品处理液的研钵中研碎，室温下放置约5min，10000rpm离心5min，取上清液100μL加入酶标板的一个孔中，37℃孵育60min；

2） 洗涤液洗板3次，每次3-5min；

3） 加入100μL工作浓度的单克隆抗体，37℃孵育90min；

4） 洗涤液洗板3次，每次3-5min；

5） 加入100μL工作浓度的酶标二抗，37℃孵育90min；

6） 洗涤液洗板5次，每次3-5min；

7） 加入新配制的底物溶液：12mL底物缓冲液+120μL TMB母液+48μL双蒸水配制的体积比1% H₂O₂，避光作用10min；

8） 加入终止液2mol/L H₂SO₄ 50μL，将酶标板放入酶标仪中用Gen5软件进行OD_450nm读数分析；

9） 结果判定：待检样品的OD_450nm值为P，阴性对照OD_450nm值为N，当P/N≥2.1时判为阳性，1.5≤P/N＜2.1时判为可疑，P/N＜1.5判为阴性。