[发明专利]用于扩增核糖核酸的方法及分析该方法中RNA或DNA模板的方法有效
| 申请号： | 201310150085.7 | 申请日： | 2013-04-26 |
| 公开（公告）号： | CN103266103A | 公开（公告）日： | 2013-08-28 |
| 发明（设计）人： | 丁少峰;刘强 | 申请（专利权）人： | 丁少峰;刘强 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 天津市三利专利商标代理有限公司 12107 | 代理人： | 李蕊 |
| 地址： | 美国加州高*** | 国省代码： | 美国;US |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 扩增 核糖核酸 方法 分析 rna dna 模板 | ||
1.用于扩增核糖核酸的方法，其特征在于：是以RNA或DNA为模板合成核酸的方法，包括以下具体步骤：
（a）一个3'末端被阻断的寡核苷酸引物即其3'末端有一个不可延伸的核苷酸,并与其互补的RNA模板或DNA模板产生退火；
（b）RNA依赖性DNA焦磷酸化反应或DNA依赖性DNA焦磷酸化反应以去除3'末端被阻断引物的阻断剂,从而使其成为3'末端去除阻断的引物；
（c）RNA依赖性DNA聚合反应或DNA依赖性DNA聚合反应来延伸其3'末端已去除阻断的引物。
2.根据权利要求1所述的用于扩增核糖核酸的方法，其特征在于：在反应中更进一步加入第二个寡核苷酸引物，即：在步骤（c）后，
（d）该第二引物可与步骤（c）的核酸产物产生退火；
（e）DNA依赖性DNA聚合反应来延伸该第二引物从而可以达到一个指数性的扩增。
3.根据权利要求1所述的用于扩增核糖核酸的方法，其特征在于：在反应中更进一步包括第二个3'末端被阻断的寡核苷酸引物，即：在步骤（c）后，
（f）第二3'末端被阻断的引物与步骤（c）的核酸产物产生退火；
（g）DNA依赖性DNA焦磷酸化反应则从被阻断引物上去除3'末端阻断剂,产生一个3'末端去除阻断的引物；
（h）DNA依赖性DNA聚合反应对3'末端已去除阻断的引物进行延伸。
4.根据权利要求1-3之一所述的用于扩增核糖核酸的方法，其特征在于：所述步骤（b）和（c），（d），（f）、（g）和（h）由聚合酶催化。
5.根据权利要求4所述的用于扩增核糖核酸的方法，其特征在于：步骤（b），（c），（d），（f），（g）和（h）都是在一个反应试管中由同一聚合酶所催化的。
6.根据权利要求4所述的用于扩增核糖核酸的方法，其特征在于：所述聚合酶是经过遗传工程优化的DNA聚合酶，根据所述SEQ ID NO：10，可在与野生型Taq聚合酶相对应的由TaqFS，TaqFS681G，TaqFS681K，TaqFS681V，TaqFS681Y，TaqFS608V681G，TaqFS599V602A605A608V681G，和TaqFS742S747I所构成的一组突变体酶中进行选择；或
根据所述SEQ ID NO：10,经遗传工程优化的突变体聚合酶可在与野生型Taq聚合酶相对应的599V，602A，605A，608V，667Y，681G，681K，681V，681R，742S，和747I位点氨基酸突变的一组突变体中选择；或
根据所述SEQ ID NO：10,经遗传工程优化的突变体聚合酶可在与野生型Taq聚合酶相对应的其氨基酸突变点位于599，602，605，608，667，681，742，和747的一组突变体中选择。
7.分析权利要求1或3-6之一所述方法中RNA模板或DNA模板的方法，其特征在于：步骤包括：
（a）RNA模板或DNA模板与其互补的寡核苷酸引物发生退火；
（b）经由RNA依赖性DNA焦磷酸化反应或DNA依赖性DNA焦磷酸化反应从引物上去除其3'末端核苷酸。
8.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于：所述引物在其3'末端带有一个不可延伸的核苷酸。
9.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于：所述步骤（b）后进一步包括：（c）延伸3'末端非延伸性引物。
10.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于：所述RNA依赖性DNA焦磷酸化反应的反应混合物包括有：（a）一种RNA模板，（b）一个互补性寡核苷酸引物，以及（c）一种核酸聚合酶；所述DNA依赖性DNA焦磷酸化反应的反应混合物包括有：（a’）一种DNA模板，（b’）一个互补性寡核苷酸引物，以及（c’）一种核酸聚合酶。
11.根据权利要求10所述的分析方法，其特征在于：所述反应混合物中的核酸聚合酶是I型DNA聚合酶。
12.根据权利要求10或11所述的分析方法，其特征在于：所述反应混合物中的核酸聚合酶是经过遗传工程优化的DNA聚合酶，根据所述SEQ ID NO：10，可在与野生型Taq聚合酶相对应的由TaqFS，TaqFS681G，TaqFS681K，TaqFS681V，TaqFS681Y，TaqFS608V681G，TaqFS599V602A605A608V681G，和TaqFS742S747I所构成的一组突变体酶中进行选择；或
根据所述SEQ ID NO：10,经遗传工程优化的突变体聚合酶可在与野生型Taq聚合酶相对应的599V，602A，605A，608V，667Y，681G，681K，681V，681R，742S，和747I位点氨基酸突变的一组突变体中选择；或
根据所述SEQ ID NO：10,经遗传工程优化的突变体聚合酶可在与野生型Taq聚合酶相对应的其氨基酸突变点位于599，602，605，608，667，681，742，和747的一组突变体中选择。
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