[发明专利]一种工业黄酒酵母单倍体的分离方法

权利要求书

1.一种工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于通过同源重组将所述工业黄酒酵母的HO基因进行了敲除；该分离方法具体操作步骤如下： 

（1）HO基因敲除组件的构建：首先利用普通PCR扩增得到黄酒酵母HO基因的上、下游同源臂扩增片段以及带有G418抗性标记的kanMX基因扩增片段，再通过降落PCR扩增得到上述三个片段的融合片段，最后利用普通PCR对所述融合片段进行特异性扩增即得黄酒酵母HO基因敲除组件；所述上游同源臂扩增片段包括上游同源臂序列及与kanMX基因5’端互补的序列(简称序列A)，所述下游同源臂扩增片段包括下游同源臂序列及与kanMX基因3’端互补的序列（简称序列B）；所述kanMX基因扩增片段包括kanMX基因序列及位于该片段两端分别与上游同源臂序列3’端、下游同源臂序列5’端互补的序列（分别简称序列C和序列D）；所述kanMX基因序列与所述序列C、序列D之间均含有可被Cre重组酶识别的loxp位点；所述序列A、序列B、序列C和序列D均为20～30bp； 

（2）黄酒酵母HO基因的敲除：将步骤（1）所得HO基因敲除组件转化工业黄酒酵母菌株，通过G418抗性筛选获得阳性转化子并鉴定； 

（3）黄酒酵母单倍体的分离：取步骤（2）中鉴定正确的阳性转化子接种于YPD培养基进行活化；收集酵母泥并将其堆积于生孢培养基，于26～28℃培养3～5d；挑取所述生孢培养基上的菌落，经蜗牛酶酶解破壁处理得酶解菌液，振荡打散孢子，再涂布于YPD培养基于28～30℃培养至菌落长出，挑取菌落经鉴定正确后得到含有抗性基因kanMX的单倍体菌株； 

（4）抗性基因的切除：将含有Cre重组酶基因的工程质粒转化步骤（3）所得单倍体菌株，取阳性克隆转化子接种于半乳糖培养基连续培养5～10代，诱导Cre重组酶表达以切除抗性基因kanMX，得到抗性基因丢失菌株；将该菌株连续培养10代以上，丢失上述工程质粒，即得不含外来抗性基因的工业黄酒酵母单倍体菌株。 

2.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于：步骤（1）所述降落PCR扩增反应无引物参与，其扩增条件如下：95℃预变性4～5min，98℃变性10～15s，70℃退火15～30s，每个循环退火温度降低1℃，共15个循环，于72℃延伸2.5～3min，然后于55℃退火温度下再循环一次，最 后于72℃再延伸5～10min。 

3.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于：步骤（1）所述上游同源臂扩增片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。 

4.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于：步骤（1）所述下游同源臂扩增片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。 

5.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于：步骤（1）所述kanMX基因扩增片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。 

6.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于：步骤（1）所述融合片段的特异性引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示。 

7.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于：步骤（3）所述活化温度为30℃，培养时间24～36h。 

8.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于：步骤（4）所述含有Cre重组酶基因的工程质粒选自pSH47、pSH62、pSH63或pSH65。 

9.根据权利要求1所述工业黄酒酵母单倍体的分离方法，其特征在于：步骤（4）所述半乳糖培养基含有100μg/mL的博来霉素。