[发明专利]一株苏云金芽孢杆菌及其应用

说明书

本申请是申请日为2011年11月29日，申请号为：201110387753.9，发明名称为“一种Bt蛋白Cyt3Aa1、其编码基因及应用”的专利申请之分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的Bt蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

多年来，人类对蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点，并且避免了化学防治带来的一系列问题。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白（Insectididal crystal proteins，简称ICPs）是由cry基因和cyt基因编码的。人们已经分离克隆了470多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N.,et al.1998.Microbiol Mol Biol Rev,62:807-813;http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。Cyt蛋白最早是在对双翅目昆虫具有毒性的Bt以色列亚种中发现的，它是Bt在芽孢阶段产生的δ-内毒素组成。截止2010年12月，已发现的Cyt蛋白共有31种，根据氨基酸序列同源性可分Cyt1和Cyt2两大类。Cyt蛋白对埃及伊蚊杀虫活性测定表明：Cyt1Aa、Cyt1Ab1、Cyt2Aa1和Cyt2Ba1都对伊蚊有活性，但是Cyt1蛋白的活性高于Cyt2类（Qi Donglai,Li Yidan,Gao Jiguo.2005.Journal of Northeast Agricultural University.12(1):5-10.）。自然界水体中广泛生长着可作为蚊幼虫食物的蓝藻。1996年,闫歌等将携带有Bt杀虫晶体蛋白基因的pDC26穿梭质粒,通过接合转移导入多种鱼腥藻中进行表达。所得到的基因工程藻Anabaena sp.7120、A nabaena cylidrica 和Anabaena subtropic对淡色库蚊幼虫,24h半数致死浓度(LC₅₀)分别为:3.51×10⁴细胞/mL、3.32×10⁴细胞/mL和4.34×10⁴细胞/mL。工程藻在连续传代50余次的情况下,仍能对淡色库蚊幼虫有较高的毒杀作用;在不加抗菌素条件下,穿梭质粒稳定,杀蚊幼虫毒效水平与加抗菌素培养的工程藻相差不大,为持续控制蚊幼虫的研究提供了新的途径。

由于Cyt蛋白与Cry蛋白具有不同的作用原理，Cyt蛋白对某些Cry蛋白具有增效作用，使其越来越受到关注。研究发现，Cyt蛋白对双翅目害虫的作用并不主要在于其毒力本身,而在于它能增强其它杀虫晶体蛋白的杀虫活性，例如：Cyt1Aa蛋白与Bt以色列亚种其它Cry蛋白之间存在着明显的协同作用，将Cyt1Aa与Bt以色列亚种其它杀虫蛋白按照不同比例进行混合，发现比单个蛋白的毒力提高了4～10倍（Crickmore N,et al.1995.FEMS Microbiol Lett,131:249-254）。