[发明专利]一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱及其制备方法和用途

说明书

技术领域：

本发明涉及一种玉米赤霉烯酮的免疫亲和柱及其制备方法和用途。属食品安全检测领域。

背景技术：

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，是一种2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，具雌激素活性，化学名称为6-(10-羟基-6-氧基碳烯基)-β雷锁酸-μ-内酯。是由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等产生的真菌毒素。它广泛存在于自然界，对动物的生长发育有着重要的作用，具有很强的雌性激素作用，可引起猪、大鼠、小鼠、家禽等多种动物和人的雌激素过多综合征，还具有生殖发育毒性、免疫毒性、基因毒性及可疑致癌性等。主要污染玉米、小麦、大麦等粮谷类作物，。Plcinta对世界上近二十个国家的谷物和动物饲料中的真菌毒素含量做了一个调查，发现大多数国家的谷物和动物饲料中都不同程度地受到ZEN的污染并导致家禽的毒害，我国的江苏、四川、河北、上海郊区等地也发生过因ZEN导致猪中毒的事件。为了控制ZEN对人和动物产生的危害，至2003年，世界上已有19个国家制订了食品中ZEN限量标准，而且欧盟于2005年制定了食品中ZEN统一限量标准。例如澳大利亚规定谷物中ZEN的含量不能超过50ng/g，意大利规定在谷物和谷类产品当中ZEN的含量不能超过100ng/g，而在法国，植物油和谷类当中ZEN的含量必须低于200ng/g。目前，中国尚未建立食品中ZEN的国家标准检测方法，为保护中国在世界粮食贸易中的经济利益和消费者健康，迫切需要建立测定ZEN的国家标准检测方法，并制订其限量标准。

目前玉米赤霉烯酮的检测方法有薄层层析法、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫分析法等。

其中薄层层析法是最早使用也是最广泛使用的检测玉米赤霉烯酮的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低，无需价格昂贵的仪器，。但是薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量，主观影响较大，灵敏度不高等，已远远不能满足现代检测要求。

酶联免疫吸附试验(EL ISA)检测方法检测特异、快速、灵敏度高、并且成本较低。成本低的特点，适用于基层机构大量样品的筛选和普查，可以大大节省时间和费用，因此越来越受到基层检验单位的欢迎。ELISA方法的主要问题是容易造成假阳性。因此主要用于基层的筛查检测。

高效液相色谱法(HPLC)具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，是目前常用于食品中毒素检测的方法。但因其对样品中毒素纯度的要求较高，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的需要，所以使用受到限制。今年来发展起来的免疫亲和柱-高效液相色谱(IAC-HPLC))将免疫亲和纯化技术与高效液相色谱相结合。使HPLC的使用更加广泛。免疫亲和柱作为一种新的净化技术，在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。它是将特异性抗体结合到活化的固相载体上填充而成。当样品提取液通过柱子时，其中的抗原与抗体结合，其他杂质则通过水溶液洗掉，再用有机溶剂将抗原即毒素洗脱下来，从而使样品中的毒素得以净化。Angelo等[J Chromatogra2phy A，1998，815：133～140.9]用乙腈2水(90∶10)提取玉米样品，用VicamZEN免疫亲和柱进行纯化，并用反相HPLC检测。在0.1～10μg/g的加标水平的回收率为93％～99.5％，相对标准偏差为6％，检出限为3ng/g，信噪比3∶1。

目前制备免疫亲和纯化柱的方法大概有：溴化氰活化直接偶联法、环氧氯丙烷法、过碘酸钠法等。这些方法的基本原理都是将载体基质进行化学活化后，将抗体偶联到载体上。但是由于偶联是非特异性的，抗体的任何部位都有可能和载体偶联，方向性是不可控制的。势必影响亲和纯化柱纯化玉米赤霉烯酮的效率。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种玉米赤霉烯酮免疫亲和柱及其制备方法和用途

为了达到上述目的，在本发明中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合。并且具有很高的亲和力。我们克隆了蛋白G的基因序列，并且对其密码子进行了优化、重组后，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。将基因重组的蛋白G偶联到载体上后，再将玉米赤霉烯酮抗体偶联到蛋白G上，制备出了玉米赤霉烯酮-蛋白G-载体，再用交联剂将载体进行交联。交联后的载体装柱后就形成了高亲和力的玉米赤霉烯酮免疫亲和柱。该亲和柱操作简便，纯化玉米赤霉烯酮效率高。样本经过简单的处理后就可以进行纯化，得到纯度很高的玉米赤霉烯酮。用于高效液相色谱检测和荧光仪检测。

具体操作如下：