[发明专利]牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）自杀性同源重组质粒的构建

①以牛布鲁氏菌S19基因组DNA为模板做PCR扩增，用引物P1和P2扩增，得到bp26基因的上游同源臂；用引物P3和P4扩增，得到bp26基因的下游同源臂；用引物B1/B2扩增，得到BLS基因；用引物B3/B4扩增，得到L7/L12基因；

P1：5’-GATGGTACCCGATGCAGCAAGACAGTATT-3’；

P2：5’-CCTCGTGCTTGGACATAAAATCTCCTACAGGAAAAGTT-3’；

P3：5’-AAGGTTGAACTCAAGTAAATAGCCGGGGTATGACG-3’；

P4：5’-CGAGAGCTCGTGGCATCCCCTTGTTTC-3’；

B1：5’-ATGTCCAAGCACGAGGC-3’；

B2：5’-GGAACCTGGAGAGGCTCCGAATTTTTT-3’；

B3：5’-AGCCTCTCCAGGTTCCGCTGATCTCGCAAAGATCGTT-3’；

B4：5’-TTACTTGAGTTCAACCTTGGCG-3’；

②利用Overlap PCR的方法，首先将步骤①制备的BLS基因和L7/L12基因相连接，连接好的片段再与步骤①制备的bp26基因的上、下游同源臂进行Overlap PCR，得到了用于同源重组的目的片段Δbp26-BL；

③用SacI和KpnI分别对自杀性质粒载体pRE112和Δbp26-BL基因片段进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段Δbp26-BL和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE-Δbp26-BL；

（2）牛布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选

①将自杀性同源重组质粒pRE-Δbp26-BL导入牛布鲁氏菌基因缺失株

S19-Δbp26的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子；同引物P1和P4将PCR鉴定正确的同源重组单交换子在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中培养，松弛质粒抗性；

②接着将同源重组单交换子涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE-Δbp26-BL中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物P1和P4对TSA-YE-Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到牛布鲁氏菌重组菌S19-Δbp26-BL；

所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基的组成如下：胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基+蔗糖，蔗糖的终浓度为质量体积比7%。

2.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：步骤（1）①中所述的PCR扩增的条件为94℃5min；94℃30s、53℃30s、72℃1min，30个循环；72℃5～10min。

3.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：步骤（1）②中所述的Overlap PCR的条件为94℃5min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃3min，30个循环；72℃5～10min。

4.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：步骤（2）①中所述的导入的方式为通过电转化方式导入。

5.根据权利要求4所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：所述的电转化的条件为1mm电极杯，1.8kv，400Ω。

6.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：步骤（2）①中所述的氯霉素在所述的胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基中的终浓度为5μg/ml。

7.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：

步骤（2）①中所述的培养的条件为37℃培养36～48h；

步骤（2）②中所述的培养的条件为37℃培养至少48h。