[发明专利]水通道蛋白1启动子荧光素酶报告基因的重组与药物筛选应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人水通道蛋白1(AQP1)启动子荧光素酶报告基因重组、构建AQP1启动子涎腺细胞模型及药物筛选的应用。

背景技术

舍格伦综合征是一种侵犯涎腺、泪腺等外分泌腺为主的自身免疫性疾病。主要临床表现为唾液分泌减少，导致唇干、皲裂、猖獗龋、口腔黏膜溃疡、真菌和病毒感染并伴有灼痛，异物感等。随着人们生活方式的变化，其发病率越来越高，在成人发病率达0.5％-3.0％，好发于中老年女性，男女比例为1∶9。到目前，尚无有效的治疗药物，因此开发有效的舍格伦综合征治疗药物具有重要的现实意义。

近年来国内外研究显示水通道蛋白(aquaporins，AQPs)与舍格伦综合征的发病密切相关，特别是水通道蛋白1(AQP1)是唾液分泌过程中的关键基因，它广泛表达于颌下腺、舌下腺和腮腺中；高表达的AQP1与唾液的分泌量密切相关，成为治疗舍格伦综合征重要的分子靶点。

AQP1表达受启动子区域的调控，在此发明中，我们利用基因重组技术，采用PCR的方法，从人类基因组中扩增出了1868bp的AQP1启动子序列，并将其克隆到荧光素酶报告基因载体上。将荧光素酶报告基因的重组质粒转染到腺样囊性癌(ACC-M)中，研究中药成分对AQP1启动子表达的影响，筛选出人参和西洋参成分能够显著激活AQP1启动子的活性。本发明以水通道蛋白1为靶点，构建涎腺细胞AQP1启动子模型是筛选哪些中药成分能治疗舍格伦综合征的关键步骤，并筛选出人参和西洋参成分能显著激活AQP1启动子的活性，为开发舍格伦综合征治疗药物提供实验依据。

发明内容

本发明是基于舍格伦综合征的典型临床表现和治疗难点，通过构建AQP1启动子荧光素酶报告基因，构建涎腺细胞AQP1启动子模型，，应用于药物筛选，对于开发治疗舍格伦综合征的药物具有重要的应用价值。

利用基因工程技术，通过NCBI数据库查找AQP1启动子序列，应用primer premier5.0设计AQP1启动子的引物，以人类基因组为模板进行PCR。扩增得到的片段与pMD18-T载体连接，经酶切鉴定并测序后，将片断亚克隆到pGL2载体上，构建pGL2-AQP1p重组质粒，通过酶切鉴定和测序进行验证，实现了AQP1启动子-Luc表达载体的重组。随后将重组质粒转染至ACC-M细胞中，用于中药的筛选，研究发现一定浓度的人参和西洋参成分可使AQP1启动子活性增高。

这段启动子的氨基酸序列为：

tacaggcact taggggaatg aatcttcccc acctgcagcc ccagcaaaca cacaccaggc 60

tggtccctgg caattcaccc caagagccag gccacagctg ggcagagggg tggccagtaa 120

cagctggtgt cattctctgc aggatagccc ctggacaaga ggcataagac ccactcatcc 180

ttgccctgcc ccaggcacac ttagaaaagt cctctcaccg ggcctcagtt tcccacctat 240

aaatgggaag atgccaacac gcccgagtgg gactgtggtg gggcaggcag gaggtgggag 300

gagagcccag atcatcccag gccttcccta ggggacgcag ggggaccctc ccttctgggc 360

ctggttcttc cagcacgttc catgcagcag gcaagagggc caggcccagg ggttcctgac 420

agcttgctgg ccctggagtc cagattcttg tttgttggct ggcgctaggc ctctggattg 480

gagatgcccg gggcacaggc ggcccacggg gatctgcagc agggcctcgg cccctccctc 540

tgcaggggct cgtctggtcc ctcccgctct ctgcctctcc tcatttatct ctccctttct 600

gcttcttggc tctgggtcca gtcctatctc ccctgtttca gtttgtcttt tcctagccct 660