[发明专利]一种杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体筛选方法，特别是一种杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的筛选方法。

背景技术

双抗体夹心法是临床体外诊断检测抗原最常用的ELISA方法，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原的定量检测。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。

传统的经典双抗体夹心目标抗体筛选方法需要采用杂交瘤技术制备单克隆抗体（简称单抗），在单抗纯化后通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性，还有抗体类型、相对亲和力测定，应用纯化的单抗建立双抗体夹心ELISA检测方法筛选适合检测的配对抗体。传统方法制备单抗时，需要针对特定免疫原的所有的阳性克隆进行扩大培养并进行单抗纯化。但是，制备出的单抗并不一定能针对该免疫原进行双抗体夹心配对，制备存在一定的盲目性。即使筛选出针对免疫原可以进行双抗体夹心配对的抗体，临床检测血清效果时也存在很大的差异。

发明内容

本发明的目的是提供一种效率高、且可有目的地进行单抗纯化工作的杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的筛选方法，以解决现有技术中存在的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种杂交瘤细胞上清阶段微量抗体的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：

（1）取细胞融合后所形成的杂交瘤细胞的培养上清液，通过盐析法去除杂质后更换缓冲体系，获得预处理上清液；

（2）将步骤（1）中得到的预处理上清液中的抗体固定至微透镜阵列芯片；

（3）对步骤（2）的微透镜阵列芯片进行阳性反应，确认上清液中抗体活性及在微透镜阵列芯片上的固定情况；

（4）将步骤（1）中得到的预处理上清液标记辣根过氧化物酶；

（5）使用免疫原及固定上清蛋白芯片对标记上清液分别进行双抗体夹心反应筛选配对情况，然后通过复核、阴性对照确认、天然蛋白验证得出的适合的配对上清。

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（1）的具体操作方法是：a）取细胞融合后所形成的杂交瘤细胞的培养上清液，向所述上清液加入上清液体积的80%～150%的饱和硫酸铵溶液，在2～8℃条件下沉淀8～15h，在高速冷冻离心机中，离心分离后得到沉淀物；b）所述沉淀物用0.4ml缓冲液溶解，用超滤管离心分离，重复超滤2～6次后得到预处理上清液；

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（2）的具体操作方法是：a）所述步骤（1）获得的预处理上清液用点样缓冲液稀释5～20倍后点样至微透镜阵列芯片；b）在25～37℃条件下孵育30～120min后用PBST洗板3～6次，加入封闭液，在2～8℃条件下孵育8～15小时；

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（3）的具体操作方法是：a）向所述步骤（2）获得的微透镜阵列芯片加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠，在25～37℃条件下孵育30～120min后，PBST洗涤3～6次；b）使用化学发光扫描仪扫描得出可反映上清液与微透镜阵列芯片的结合情况的图像；

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（4）的具体操作方法是：将步骤（1）中得到的预处理后上清液用过碘酸钠氧化法标记上辣根过氧化物酶；

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（5）的具体操作方法是：a）将免疫原用封闭液稀释至0.1～1μg/ml，加入步骤（2）处理过的微透镜阵列芯片的微孔内，在25～37℃条件下孵育60～150min；b）PBST洗涤2～6次；c）在微透镜阵列芯片的微孔内加入用封闭液5～20倍稀释的步骤（3）处理的辣根过氧化物酶标记上清液的，25-37℃孵育60～150min；d）PBST洗涤5～8次；e）使用化学发光扫描仪扫描，得出图像；f）根据图像，微透镜阵列芯片上有光信号的点所对应的上清液即为可以配对的上清液；g）得出的配对上清液重复步骤（6）中的a)～e)的反应，同时在进行步骤a)时增加以封闭液代替免疫原进行反应的阴性对照；当阴性对照微透镜阵列芯片无光信号，且免疫原反应有信号时，确定配对信息的真实有效；h）对于筛选出的配对上清，使用天然蛋白质代替免疫原重复步骤（6）中的a)～e)的反应，得出光信号的数值与临床检测浓度线性拟合评价，筛选出最适合临床检测的配对上清信息。

如上所述的筛选方法，优选地，所述步骤（1）中离心分离操作的离心力是10000～15000g，运行时间是10～30min。

如上所述的筛选方法，优选地，所述超滤管的截留分子量小于上清液中抗体的分子量。